許秀芳， 辛 毅， 汪勁松， 趙莉敏， 杜蘭萍， 葛桂玲，李 娜， 張 穎， 王世強(qiáng)， 黃益民， 羅 毅

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院，北京市心肺血管疾病研究所1細(xì)胞與分子生物學(xué)研究室，3實(shí)驗(yàn)中心，北京100029;2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院心外科，北京100045;4北京放射醫(yī)學(xué)研究所，北京100850;5北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京100871;6北京中醫(yī)藥大學(xué)電鏡室，北京100029)

肌球蛋白輕鏈2v(myosin light chain 2v，MLC2v)的表達(dá)在胚胎心臟發(fā)育形成過程中起很重要的作用，MLC2v表達(dá)的異常改變將導(dǎo)致心臟缺陷，例如人類心肌病與MLC2v的點(diǎn)突變相關(guān)。無論在胚胎發(fā)育和出生后的嬰兒發(fā)育或成熟期，MLC2v都具有心臟高度特異性。MLC2v基因的啟動(dòng)子(myosin light chain 2v gene promoter，pMLC2v)是3 kb 的片段，心臟特異性序列位于250 bp內(nèi)，接近于TATA box［1］。有報(bào)道利用心室肌特異的MLC－2v啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)EGFP，研究了大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)分化心室肌細(xì)胞的過程，不僅證明轉(zhuǎn)染pMLC2v-EGFP并不影響大鼠MSCs的生長(zhǎng)和向心室肌樣細(xì)胞分化的能力，還證明EGFP在MLC－2v啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下能特異、有效標(biāo)記大鼠骨髓MSCs來源心室肌樣活細(xì)胞［2］。為了尋找一種能夠示蹤人MSCs分化為心肌細(xì)胞的特異性報(bào)告基因，本研究擬構(gòu)建的心肌肌球蛋白輕鏈2v啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)和螢光素酶(luciferase，Luc)報(bào)告基因慢病毒載體［3-6］，轉(zhuǎn)染人心肌細(xì)胞系(human cardiomyocyte cell line，HCM)和人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，觀察2種細(xì)胞中報(bào)告基因的整合表達(dá)特征，以及pMLC2v-GFP和pMLC2v-Luc是否具有心肌細(xì)胞特異性，為利用多個(gè)報(bào)告基因同步示蹤實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活體內(nèi)人MSCs的歸巢、遷移和分化等多個(gè)生命特征奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青霉素和鏈霉素均購(gòu)自Gibco。胰蛋白酶(Sigma)。羊抗人心肌肌鈣蛋白(troponin)I(I抗，Santa Cruz)和FITC標(biāo)記兔抗羊IgG(Ⅱ抗，Jacson);小鼠抗人肌球蛋白輕鏈單克隆抗體(Abcam)和TRITC標(biāo)記羊抗鼠抗體IgG(Ⅱ抗，Jacson)。人心肌細(xì)胞系HCM和心肌細(xì)胞培養(yǎng)基(myocardial cell medium，MCM)購(gòu)自 ScienCell Research Laboratories。細(xì)胞培養(yǎng)板、離心管、培養(yǎng)皿等均購(gòu)自Corning。

1.2 主要儀器 激光共聚焦顯微鏡(Leica，TCS SP5 MP型)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(三洋)，高速低溫離心機(jī)和酶標(biāo)檢測(cè)儀(Beckman)，生物發(fā)光成像系統(tǒng)(IVIS LuminaⅡ型)，細(xì)胞電刺激器(北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院自制)，透射電子顯微鏡(JEM-1230)。

2 方法

2.1 慢病毒載體的包裝與鑒定 參照前期的方法［3］，分別應(yīng)用pMLC2v-GFP和pMLC2v-Luc質(zhì)粒，與含有HIV-1病毒gag、pol和rev等基因的pHelper 1.0質(zhì)粒(編碼病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白)、含有單純皰疹病毒VSVG基因的pHelper 2.0質(zhì)粒(提供病毒包裝所需要的衣殼蛋白)構(gòu)建pMLC2v-GFP或pMLC2v-Luc報(bào)告基因慢病毒載體。同時(shí)構(gòu)建非特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GFP(common promoter-driven GFP，GFPC)和非特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)紅色熒光蛋白(common promoter-driven red fluorescent protein，RFPC)報(bào)告基因的慢病毒載體。

2.2 pMLC2v-GFP、GFPC和 RFPC轉(zhuǎn)染 HCM 和 A549細(xì)胞

HCM采取如下方法培養(yǎng):在35 mm共聚焦專用培養(yǎng)皿中加入1 mL MCM培養(yǎng)液，分別將實(shí)驗(yàn)和對(duì)照孔中加入1×105個(gè)原代HCM細(xì)胞，于37℃、5%CO2、95%濕度條件下培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)孔于第2 d換液后分別以pMLC2v-GFP、GFPC單獨(dú)轉(zhuǎn)染和pMLC2v-GFP和RFPC共同轉(zhuǎn)染，每2 d換液，分別于第 3 d、7 d、14 d、18 d、21 d 后吸出培養(yǎng)液，用 PBS 洗 2 遍，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)。對(duì)照孔每3 d換液1次，光鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。采用RPMI-1640培養(yǎng)基按照常規(guī)培養(yǎng)方法培養(yǎng)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，取第2代培養(yǎng)細(xì)胞作為對(duì)照孔細(xì)胞，轉(zhuǎn)染與檢測(cè)步驟同上。

2.3 pMLC2v-Luc轉(zhuǎn)染 HCM和 A549細(xì)胞 24孔板加入MCM培養(yǎng)液，將1×105個(gè)細(xì)胞加入孔中，于37℃、5%CO2、95%濕度條件下培養(yǎng)，第2 d換液后轉(zhuǎn)染pMLC2v-Luc，每2 d 換液，分別于第 3 d、7 d、14 d、18 d、21 d 吸出培養(yǎng)液，用 PBS洗2遍，生物發(fā)光成像系統(tǒng)定期檢測(cè)。肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549作為對(duì)照孔，轉(zhuǎn)染與檢測(cè)步驟同上。

2.4 慢病毒載體轉(zhuǎn)染報(bào)告基因表達(dá)的檢測(cè)

2.4.1 GFPC、RFPC和 pMLC2v-GFP 表達(dá)的熒光成像檢測(cè)分別于 GFPC、RFPC和 pMLC2v-GFP報(bào)告基因轉(zhuǎn)染人HCM 和 A549 2 種細(xì)胞 3 d、7 d、14 d、18 d、21 d 時(shí)，用激光共聚焦顯微鏡觀察。紅色熒光用614 nm、綠色熒光用488 nm的激發(fā)波長(zhǎng)對(duì)不同轉(zhuǎn)染方式的2種細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞斷層掃描和三維圖像合成，并將2種波長(zhǎng)的熒光成像相互重疊。分析比較報(bào)告基因轉(zhuǎn)染后，不同細(xì)胞中報(bào)告基因的表達(dá)時(shí)相和表達(dá)特征。

2.4.2 Luc表達(dá)的發(fā)光成像檢測(cè) 分別于Luc報(bào)告基因轉(zhuǎn)染人 HCM 和 A549 2 種細(xì)胞 3 d、7 d、14 d、18 d、21 d 時(shí)，用生物發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)2種細(xì)胞對(duì)Luc的表達(dá)。在未轉(zhuǎn)染報(bào)告基因的HCM培養(yǎng)孔中分別加入15 g/L螢光素(Luciferin)100 μL作為陰性對(duì)照、加入Luciferase+Luciferin作為陽性對(duì)照;在轉(zhuǎn)染報(bào)告基因的HCM培養(yǎng)孔中加入15 g/L熒光素100 μL、不加反應(yīng)底物作為空白對(duì)照。A549細(xì)胞的檢測(cè)方法相同。

2.5 免疫熒光鑒定人心肌肌鈣蛋白I和MLC2v的表達(dá) 取pMLC2v-Luc轉(zhuǎn)染前和轉(zhuǎn)染21 d后的HCM和A549細(xì)胞接種于鋪有蓋玻片的24孔板中，24 h后PBS洗3次，每次2 min;40 g/L多聚甲醛(pH 7.2)固定40 min，PBS洗3次，每次2 min;3 g/L Triton X-100室溫封閉1 h，PBS洗3次，每次2 min;200 μL 胎牛血清室溫封閉 1 h，取 100 μL 1∶100 稀釋的羊抗人心肌肌鈣蛋白I和小鼠抗人MLC2v單克隆抗體滴到有2種細(xì)胞的蓋玻片上，室溫孵育1.5 h，PBS洗3次，每次2 min;分別加入1∶100 FITC標(biāo)記的兔抗羊抗體IgG和TRITC標(biāo)記的羊抗鼠抗體IgG，室溫避光孵育1 h，PBS洗3次，每次2 min，激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。

2.6 HCM超微結(jié)構(gòu)鑒定 分別取轉(zhuǎn)染pMLC2v-Luc前和轉(zhuǎn)染后表達(dá)Luc的HCM，PBS洗3次，每次2 min;2.5%戊二醛固定，包埋，切片，透射電子顯微鏡觀察超微結(jié)構(gòu)。

2.7 HCM興奮-收縮偶聯(lián)功能檢測(cè) 分別將未轉(zhuǎn)染報(bào)告基因和轉(zhuǎn)染pMLC2v-GFP的HCM加入2 μmoL/L的Fluo4-AM和2 mmol/L的Ca2+，37℃孵育5 min;于垂直心肌細(xì)胞長(zhǎng)軸的細(xì)胞兩端用白金電極施加10 V、1 Hz、10 ms波寬的脈沖電刺激，激光共聚焦顯微鏡連續(xù)觀察記錄人心肌細(xì)胞系內(nèi)的鈣火花和細(xì)胞收縮發(fā)生情況，每組共觀察10個(gè)細(xì)胞，檢測(cè)人心肌細(xì)胞系的興奮-收縮偶聯(lián)功能。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間的比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HCM轉(zhuǎn)染GFPC后GFP的表達(dá)

激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，HCM的增殖周期約為7 d，培養(yǎng)21 d時(shí)，細(xì)胞數(shù)為原代細(xì)胞數(shù)的4～5倍，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，顯示培養(yǎng)21 d時(shí)有大量新增殖的心肌細(xì)胞，可用于長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)觀察，特別是可以進(jìn)行新生心肌細(xì)胞的觀察研究。實(shí)驗(yàn)孔的HCM轉(zhuǎn)染GFPC后第3 d時(shí)表達(dá)GFP，表達(dá)特征為細(xì)胞核和細(xì)胞漿中均有較強(qiáng)表達(dá)，顯示細(xì)胞核、核仁以及部分肌絲的輪廓，見圖1。GFPC可在原代HCM中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)。轉(zhuǎn)染GFPC的A549細(xì)胞也表達(dá)GFP(結(jié)果未顯示)。

Figure 1.GFP expression in HCM 3 d after transfected with GFPC.A:×100;B:×400.圖1 人心肌細(xì)胞系HCM轉(zhuǎn)染GFPC后第3 d GFP的表達(dá)

2 HCM細(xì)胞轉(zhuǎn)染pMLC2v－GFP后表達(dá)GFP

HCM轉(zhuǎn)染pMLC2v-GFP 21 d后表達(dá)GFP，見圖2B～D。表達(dá)特征為細(xì)胞核和細(xì)胞漿全細(xì)胞表達(dá)，可清晰顯示細(xì)胞以及細(xì)胞核形態(tài)。這提示pMLC2v主要在培養(yǎng)21 d后新增殖的心肌細(xì)胞中穩(wěn)定驅(qū)動(dòng)GFP表達(dá)，在原代心肌細(xì)胞中不表達(dá)。轉(zhuǎn)染pMLC2v-GFP基因的A549細(xì)胞不表達(dá)GFP，見圖2A。

Figure 2.GFP expression in HCM and A549 cells 21 d after transfected with pMLC2v-GFP.A:A549 cells(×100);B:HCM(×100);C:HCM(×400);D:HCM(×1 000).圖2HCM轉(zhuǎn)染pMLC2v－GFP后21 d表達(dá)GFP

3 pMLC2v－GFP和RFPC慢病毒載體共轉(zhuǎn)染HCM后表達(dá)雙報(bào)告基因

pMLC2v-GFP和RFPC共轉(zhuǎn)染后3 d，HCM表達(dá)RFP，表達(dá)特征為胞漿中呈顆粒狀較強(qiáng)表達(dá)(圖3A)。轉(zhuǎn)染后21 d，HCM開始表達(dá)GFP，表達(dá)特征為全細(xì)胞表達(dá)但以胞漿中表達(dá)量稍高(圖3B)。大部分HCM細(xì)胞同時(shí)表達(dá)RFP和GFP，但兩者的表達(dá)強(qiáng)度各有不同(圖3C，細(xì)胞呈黃色)，部分細(xì)胞對(duì)2種報(bào)告基因均高效表達(dá)而呈金黃色，部分細(xì)胞RFP表達(dá)量較高而呈橘黃色或橘紅色。少量細(xì)胞只表達(dá)RFP(圖3C，細(xì)胞呈紅色)或只表達(dá)GFP(圖3C，細(xì)胞呈綠色)。這提示RFPC在原代和新增殖HCM中的穩(wěn)定表達(dá)，并不影響pMLC2v-GFP在新增殖心肌細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)，說明HCM可進(jìn)行雙報(bào)告基因的轉(zhuǎn)染示蹤。A549細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后3 d開始表達(dá)RFP，未表達(dá) GFP。

4 HCM轉(zhuǎn)染pMLC2v－Luc后表達(dá)Luc

HCM轉(zhuǎn)染pMLC2v-Luc后21 d檢測(cè)到強(qiáng)的生物發(fā)光信號(hào)，見圖4E2、F1、F2、F3，說明細(xì)胞表達(dá) Luc;而 A549 細(xì)胞系并不發(fā)光，見圖 4B1、B2、B3、B4。I組:轉(zhuǎn)染 pMLC2v-Luc的HCM+luciferin發(fā)光的平均光通量為(8.43±0.98)×104p·s-1·cm-2·sr-1;Ⅱ組:轉(zhuǎn)染pMLC2v-Luc的人A549+luciferin發(fā)光的平均光通量為(0.27±0.54)×104p·s-1·cm-2·sr-1，2組比較差異顯著(P＜0.01)。這進(jìn)一步提示pMLC2v驅(qū)動(dòng)Luc只在新增殖的人心肌細(xì)胞系中表達(dá)，在原代細(xì)胞和A549細(xì)胞系中不表達(dá)，可用于心肌細(xì)胞活體生物發(fā)光示蹤。

5 表達(dá)Luc的HCM免疫熒光染色結(jié)果

轉(zhuǎn)染pMLC2v-Luc前，人HCM的肌鈣蛋白 I和MLC免疫熒光染色均呈陽性，清楚可見胞漿中沿細(xì)胞長(zhǎng)軸分布的肌絲結(jié)構(gòu)(圖5)，證明本研究采用的原代人心肌細(xì)胞系具有典型的正常人心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白成分表型。轉(zhuǎn)染pMLC2v-Luc 21 d后，表達(dá)Luc的HCM仍然表現(xiàn)為肌鈣蛋白I和MLC免疫熒光染色陽性，兩種蛋白分布于胞漿中(圖5)，證明新增殖的心肌細(xì)胞仍保持了典型的正常人心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白成分表型。A549細(xì)胞系在轉(zhuǎn)染pMLC2v-Luc前后的肌鈣蛋白I和MLC免疫熒光染色均為陰性。

6 HCM的超微結(jié)構(gòu)

電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，HCM并沒有正常成人心肌細(xì)胞中的肌絲、肌小節(jié)和肌絲束間排列的線粒體等典型的超微結(jié)構(gòu)，但多見條索狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和分布不均的線粒體;線粒體的形態(tài)正常，但體積明顯小于正常成人心肌線粒體，見圖6。

Figure 3.RFP expression(3 d)and GFP expression(21 d)in HCM after cotransfected with pMLC2v-GFP and RFPC.圖3HCM同時(shí)轉(zhuǎn)染RFPC和pMLC2v－GFP后RFP和GFP的表達(dá)

Figure 4.Luc expression in HCM 21 d after transfected with pMLC2v-Luc.F1～3，E2:HCM+pMLC2v-Luc+luciferin;A4:HCM+Luc+luciferin(positive control);C3:HCM+luciferin(negative control);A2:HCM+pMLC2v-Luc(blank control);B1～4:A549+pMLC2v-Luc+luciferin(no luminescence).圖4 HCM轉(zhuǎn)染pMLC2v－Luc 21 d后Luc的表達(dá)

Figure 5.Immunofluorescent staining of HCM before and 21 d after transfected with pMLC2v-Luc.圖5 轉(zhuǎn)染pMLC2v－Luc前和轉(zhuǎn)染21 d后HCM的免疫熒光染色

Figure 6.Ultrastructure of HCM under transmission electron microscope.A:no typical myofilaments and sarcomere in HCM;B，C and D:strip-like endoplasmic reticulum and disarranged mitochondia.圖6 透射電鏡觀察HCM的超微結(jié)構(gòu)

7 HCM的興奮－收縮偶聯(lián)功能

對(duì)轉(zhuǎn)染pMLC2v-Luc前和轉(zhuǎn)染21 d后的HCM連續(xù)施加10 V、1 Hz、10 ms波寬的脈沖電刺激5 min，既沒有引起細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生鈣火花也沒有引發(fā)細(xì)胞的收縮或搏動(dòng)，提示本實(shí)驗(yàn)中無論是原代或新增殖的人心肌細(xì)胞系都不具備“興奮-收縮偶聯(lián)”功能。同樣，電刺激也沒有引起A549細(xì)胞收縮和細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)鈣火花。

討 論

MSCs是一種成體干細(xì)胞，具有自我更新和誘導(dǎo)分化潛能，能夠體外定向誘導(dǎo)分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和心肌細(xì)胞，甚至可“橫向”分化為神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞［7-9］，MSCs在心臟方面的研究主要集中在心肌梗死的治療上［10-14］。近年來，將細(xì)胞移植至受損心臟處替代壞死心肌，以修復(fù)心肌結(jié)構(gòu)和功能的臨床實(shí)驗(yàn)研究已取得一定進(jìn)展。一直以來，干細(xì)胞改善心功能的作用機(jī)制始終是研究的熱點(diǎn)問題。

為了追蹤觀察移植細(xì)胞的歸巢、嵌入、分布和分化進(jìn)程，必須將移植細(xì)胞加以標(biāo)記示蹤，以便于識(shí)別和監(jiān)測(cè)。良好的非侵入性示蹤劑探針必須滿足以下要求:(1)無毒;(2)不改變細(xì)胞活力、增殖、分化和其它生物活性;(3)不從標(biāo)記細(xì)胞中釋放出來而感染周圍宿主細(xì)胞出現(xiàn)假陽性標(biāo)記;(4)穩(wěn)定的代謝分解途徑;(5)足夠長(zhǎng)的半衰期;(6)能準(zhǔn)確地反映標(biāo)記細(xì)胞死亡并實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)在體檢測(cè)，具備較高的分辨率。近年快速發(fā)展的生物發(fā)光成像技術(shù)，是利用轉(zhuǎn)染Luc報(bào)告基因的細(xì)胞所表達(dá)Luc在活細(xì)胞內(nèi)的O2和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)環(huán)境中主動(dòng)催化螢光素而發(fā)出生物可見光，可以穿透5～10 mm組織，具有極低的背景和高靈敏度［15-17］，是活體示蹤細(xì)胞功能的首選探針。報(bào)告基因GFP和RFP的表達(dá)同樣可作為快速反應(yīng)探針用于指示細(xì)胞活性和功能的變化。

在基因表達(dá)調(diào)控的順式元件中，啟動(dòng)子就像“開關(guān)”一樣發(fā)揮著控制基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄的起始時(shí)間和表達(dá)程度的關(guān)鍵作用。啟動(dòng)子對(duì)外源基因的表達(dá)水平影響很大，要使克隆的報(bào)告基因能夠在目的細(xì)胞中靶向、高效和長(zhǎng)期穩(wěn)定地表達(dá)，啟動(dòng)子最好是超強(qiáng)的組織特異性啟動(dòng)子(tissue-specific promoter)［18］。組織特異啟動(dòng)子又稱器官特異性啟動(dòng)子。在這類啟動(dòng)子調(diào)控下，基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達(dá)。

成年人心肌肌球蛋白是由2條200 kD的重鏈(MHC)和4條輕鏈(MLC)構(gòu)成的六聚體，每條MHC分別與1條18～19 kD可磷酸化的調(diào)控MLC2和1條28 kD的基礎(chǔ)MLC1連接［19］。心肌肌球蛋白輕鏈MLC-2v的啟動(dòng)子屬于心肌組織特異性啟動(dòng)子［20-23］，無論是在胚胎發(fā)育期或在出生后的發(fā)育成熟期或在心臟代償重塑期［19］，其調(diào)控的MLC2v表達(dá)都具有心臟高度特異性。在心肌發(fā)育期，pMLC2v可被心肌增強(qiáng)因子2(myocyte enhancer factor-2，MEF2)和心臟特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-4協(xié)同激活，正調(diào)肌球蛋白輕鏈的基因表達(dá)［22］。在人心肌肥厚時(shí)，Ca2+-鈣調(diào)蛋白-鈣神經(jīng)素-激活T細(xì)胞的細(xì)胞核因子(Ca2+-calmodulin-calcineurin-NFAT)信號(hào)通路中的Ca2+-鈣調(diào)蛋白-鈣調(diào)蛋白依賴性激酶(Ca2+-calmodulin-CaMK)使組蛋白去乙酰轉(zhuǎn)移酶磷酸化，繼而細(xì)胞核從組蛋白釋放出活化的MEF2單體，結(jié)合到人肌球蛋白輕鏈啟動(dòng)子的MEF2結(jié)合位點(diǎn)。同時(shí)，cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)的Ser133位點(diǎn)被CaMK IV磷酸化，進(jìn)而結(jié)合到人肌球蛋白輕鏈啟動(dòng)子的結(jié)合位點(diǎn)上［20］。

正常人心室不表達(dá)肌球蛋白。因此pMLC2v處于靜默狀態(tài)。只有當(dāng)心肌損傷需要修復(fù)或心肌細(xì)胞代償重塑或新增殖心肌細(xì)胞時(shí)，pMLC2v才會(huì)被活化，啟動(dòng)和正調(diào)肌球蛋白的翻譯表達(dá)。

在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，HCM在轉(zhuǎn)染pMLC2v-GFP和pMLC2v-Luc 21 d后才開始表達(dá)報(bào)告基因GFP和Luc，這與GFPC和RFPC在第1代細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的結(jié)果明顯不同，說明了pMLC2v是在新增殖的心肌細(xì)胞中被激活進(jìn)而驅(qū)動(dòng)諸如GFP和Luc等外源基因正調(diào)表達(dá)。這是由于轉(zhuǎn)染后的pMLC2v-GFP和pMLC2v-Luc整合到第1代心肌細(xì)胞核的相應(yīng)位點(diǎn)，與細(xì)胞自有的pMLC2v都處于靜默狀態(tài)，當(dāng)心肌細(xì)胞增殖時(shí)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子活化pMLC2v，在翻譯肌球蛋白輕鏈2的同時(shí)正調(diào)兩種報(bào)告基因的表達(dá)，pMLC2v-GFP和pMLC2v-Luc也隨著細(xì)胞增殖被傳到下一代細(xì)胞。而A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染RFPC后3 d表達(dá)RFP但轉(zhuǎn)染pMLC2v-GFP和pMLC2v-Luc后始終不表達(dá)相關(guān)報(bào)告基因的結(jié)果，進(jìn)一步說明本研究構(gòu)建的pMLC2v-GFP和pMLC2v-Luc具有心肌細(xì)胞特異性。另外，對(duì)轉(zhuǎn)染pMLC2v-GFP和pMLC2v-Luc后的心肌細(xì)胞和A549細(xì)胞的肌鈣蛋白I和MLC免疫熒光鑒定結(jié)果也支持pMLC2v-GFP和pMLC2v-Luc的心肌特異性，因此本研究構(gòu)建的兩種報(bào)告指示載體可用于心肌細(xì)胞的增殖、肥大、篩選、干細(xì)胞分化心肌細(xì)胞的研究。

我們的前期研究證明，人臍帶MSCs、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株Eahy926、人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和大鼠乳鼠心肌細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)染GFPC和RFPC后，可共表達(dá)GFP和RFP，但不同細(xì)胞對(duì)每種報(bào)告基因的表達(dá)特征有所不同［4-5］。本研究中人心肌細(xì)胞共轉(zhuǎn)染RFPC和pMLC2v-GFP后可以共表達(dá)RFP和GFP，但是表達(dá)時(shí)相不一致，進(jìn)一步證明人心肌細(xì)胞可以同時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)兩種報(bào)告基因，但不同報(bào)告基因的表達(dá)時(shí)相取決于上游啟動(dòng)子的種類和整合位點(diǎn)。本研究中被轉(zhuǎn)染的多個(gè)報(bào)告基因可以同時(shí)復(fù)制到下一代心肌細(xì)胞，不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，這為利用不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)多報(bào)告基因研究心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能創(chuàng)造了條件。

心肌完整的肌絲結(jié)構(gòu)是心肌收縮的基礎(chǔ)，而豐富的線粒體為細(xì)胞收縮提供所需要的能量［24-26］。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常成年人的心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)相比較，本實(shí)驗(yàn)采用的人心肌細(xì)胞系沒有肌絲結(jié)構(gòu)以及線粒體散在分布且體積較小，證明此細(xì)胞系不是真正意義上的“正常成人心肌細(xì)胞”，這種異常的超微結(jié)構(gòu)是導(dǎo)致本實(shí)驗(yàn)中的心肌細(xì)胞不能被刺激產(chǎn)生興奮-收縮偶聯(lián)功能的最主要原因。因此，此類成年人心肌細(xì)胞系只能稱為“具有成年人心肌細(xì)胞蛋白表型的細(xì)胞”，只適合用于對(duì)人心肌細(xì)胞表型的相關(guān)研究，不適合心肌細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)研究。

本研究利用pMLC2v心肌組織特異性的特點(diǎn)，成功構(gòu)建了pMLC2v驅(qū)動(dòng)的GFP和Luc報(bào)告基因慢病毒載體pMLC2v-GFP和pMLC2v-Luc，并觀測(cè)了這兩種報(bào)告基因在原代和新增殖人心肌細(xì)胞系中的表達(dá)特征，為活體內(nèi)和體外人MSCs分化為心肌細(xì)胞進(jìn)程的研究提供一種特異性的直接實(shí)時(shí)示蹤工具。我們下一步將從分子水平證實(shí)新的心肌細(xì)胞合成，并利用心肌細(xì)胞pMLC2v-GFP和pMLC2v-Luc報(bào)告基因探針動(dòng)態(tài)示蹤人臍帶MSCs在心衰小鼠心臟中分化心肌的潛能和機(jī)制，深入探討并具體闡述MSCs治療心衰的作用機(jī)理，為解釋MSCs治療心衰的作用機(jī)理提供可視熒光和發(fā)光的直接證據(jù)。

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