李 旭， 李 鑫， 馬曉春

(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學科，遼寧沈陽110001)

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性桿菌細胞壁外膜的一種成分，是導致膿毒癥的主要因素［1］。LPS從細菌細胞膜脫落，與脂多糖連接蛋白(lipopolysaccharide－binding protein，LBP)相結合，連接到可溶型或膜型白細胞分化抗原(cluste of differentiation，CD)14，從而將其轉運至 LPS/Toll樣受體4(Toll－like receptor 4，TLR4)復合物，導致炎癥介質的產生，如腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF－ α)，白細胞介素1β(interleukin－1β，IL－1β)、IL－6和IL－8，進而發(fā)生一系列炎癥反應［2］。IL－8是一種典型的趨化因子，屬于CXC類趨化性細胞因子家族，主要由單核細胞和巨噬細胞產生，成纖維細胞、上皮細胞、樹突細胞和內皮細胞等也可以產生［3］。IL－8的主要功能是在炎癥過程中促進中性粒細胞的募集、游走、趨化至炎癥部位，釋放多種炎癥介質，引起炎癥反應和組織損傷，在膿毒癥過程中發(fā)揮重要作用［3］。近年來越來越多的研究表明內皮細胞在LPS引起的膿毒癥多器官功能障礙等病理過程中起到關鍵作用［4］。內皮細胞是機體的主要炎癥反應細胞，亦是LPS作用的靶細胞，它們襯覆于血管內壁構成血管通透性的主要屏障，能合成和分泌調節(jié)凝血－纖溶系統的物質，調節(jié)血管張力的因子以及細胞因子等，從而在創(chuàng)傷愈合及炎癥反應中起到重要作用［5］。肝素(普通肝素，或稱未分級肝素，unfractionated heparin，UFH)在臨床應用中降低膿毒癥患者發(fā)生彌散性血管內凝血、急性腎衰竭和多器官功能障礙的比率，并降低28 d病死率［6］，但具體機制并不清楚，因此，本研究旨在探討肝素對脂多糖刺激人內皮細胞IL－8水平的影響，并研究TLR4可能的影響，尋求肝素在臨床膿毒癥患者中應用的理論依據。

材料和方法

1 材料

人肺微血管內皮細胞株(HPMECs)購自上海拜力生物技術有限公司;胎牛血清(HyClone);DMEM培養(yǎng)基(HyClone);LPS(O55∶B5，Sigma);Trizol(Invitrogen);TaKaRa 反轉錄試劑盒(大連寶生物工程公司);人 IL－8 ELISA試劑盒購于R＆D。其余均為國產分析純試劑。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) HPMECs細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1～2 d換液1次。

2.2 細胞處理及分組 按照1×109cells/L密度將HPMECs接種于6孔板，每孔2 mL。實驗分為4組:正常對照組、LPS刺激組、LPS+普通肝素100 U/L組和LPS+普通肝素103U/L組。肝素作用組提前15 min應用既定濃度肝素，后加入10 mg/L濃度的LPS刺激;正常對照組應用相同劑量PBS。各組分別在培養(yǎng)2、6和12 h后收集細胞上清，測定上清中IL－8水平。于2、6和12 h收集細胞提取RNA，于－80℃保存。

2.3 細胞上清中IL－8水平測定 各組細胞分別在LPS作用2、6和12 h收集細胞上清，4 000 r/min離心20 min去除細胞碎屑，應用ELISA方法分析上清中IL－8的表達。操作嚴格按照試劑盒說明書進行，每組樣本作3個復孔。

2.4 IL－8、CD14和 TLR4 mRNA表達測定 應用 Trizol提取細胞總RNA，紫外分光光度計測定總RNA濃度和純度。應用反轉錄試劑盒進行反轉錄。采用real－time PCR測定。反應總體積:25 μL，加入 cDNA 2 μL。IL －8:上游引物 5’－CAC CGG AAG GAA CCA TCT CA －3’，下游引物5’－AGA GCC ACG GCC AGC TT －3’，各 1 μL，反應條件:95 ℃ 30 s，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個擴增循環(huán)。CD14:上游引物5’－CCC TAG CGC TCC GAG ATG －3’，下游引物 5’－GAA CGA CAG ATT GAG GGA GTT CA －3’，各1 μL，反應條件:95℃ 30 s，95 ℃ 5 s，52 ℃ 45 s，35 個擴增循環(huán)。TLR4:上游引物CCG AAG CCT TGG CGT TCT，下游引物 TCC CGG TAG TAC AGG CAG ATG，各1 μL，反應條件:94 ℃ 50 s，94 ℃ 5 s，72℃ 50 s，30個擴增循環(huán)。選取 β－actin作為內參照，IL －8、CD14 和 TLR4 mRNA 的相對表達量采用 2－ΔΔCt計算。

3 統計學處理

結 果

1 肝素對IL－8蛋白水平的影響

脂多糖刺激后IL－8蛋白表達明顯增加，隨著時間的延續(xù)逐漸上調，12 h達到高峰，肝素減少IL－8蛋白的表達，見圖1。

Figure 1.Effect of unfractionated heparin(UFH)on the expression of IL－8 protein induced by LPS in HPMECs.±s.n=3.*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs LPS group.圖1 肝素對LPS刺激的HPMECs IL－8蛋白水平的影響

2 肝素對IL－8 mRNA水平的影響

脂多糖刺激后2 h IL－8 mRNA表達增高，隨著時間的延續(xù)逐漸上調，在6 h達到高峰，肝素減少IL－8 mRNA的表達，見圖2。F

igure 2.Effect of UFH on the expression of IL－8 mRNA induced by LPS in HPMECs.±s.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs LPS group.圖2 肝素對LPS刺激的HPMECs IL－8 mRNA水平的影響

3 肝素對TLR4 mRNA水平的影響

脂多糖刺激后2 h TLR4 mRNA表達增高，隨著時間的延續(xù)逐漸上調，在6 h達到高峰，肝素減少TLR4 mRNA的表達，見圖3。

Figure 3.Effect of UFH on the expression of TLR－4 mRNA induced by LPS in HPMECs.±s.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs LPS group.圖3 肝素對LPS刺激的HPMECs TLR4 mRNA水平的影響

4 肝素對CD14 mRNA水平的影響

脂多糖刺激后沒有檢測到CD14 mRNA的表達。

討 論

TLR4是目前最為廣泛研究的TLR家族成員之一，迄今為止在人類共鑒定出了11種TLR(TLR1～TLR11)，不同的TLR識別不同的配體，TLR4識別革蘭氏陰性菌的 LPS［7］。CD14是錨定在單核細胞、巨噬細胞和多形核白細胞細胞膜表面的一種糖蛋白，分子量55 kD，其主要作為革蘭氏陰性菌的LPS高親和受體，介導細胞識別并捕獲LPS，同時將信號向細胞內轉導，激活細胞應答，在機體免疫、防御系統引起的一系列病理反應中起關鍵作用［8］。CD14以2種方式存在，膜型CD14(membrane－bound CD14，mCD14)和可溶型CD14(soluble CD14，sCD14)，其中sCD14主要存在于血清和尿液中［9］。通常認為mCD14主要表達于單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞等骨髓細胞，非骨髓細胞則通過上清液中sCD14與LPS結合［10］。根據目前的研究，LPS可通過2條途徑激活損傷的血管內皮細胞:一條途徑是LPS與血清中的LBP和sCD14結合，再通過內皮細胞上TLR4－MD－2復合物將LPS信號轉導至胞內，直接激活內皮細胞;另一條途徑是LPS先激活單核細胞、T細胞等免疫活性細胞，使其釋放TNF－α、IL－1β等細胞因子，間接激活血管內皮細胞［11］。本研究中，應用胎牛血清培養(yǎng)內皮細胞，其中含有sCD14，加入LPS刺激后，內皮細胞產生TLR4增加，并促進IL－8的表達，說明LPS通過TLR4信號途徑促進內皮細胞發(fā)生炎癥反應，與前期研究結果相一致。

肝素是一種天然形成的氨基葡聚糖，作為一種有效的抗凝劑在臨床應用已超過半個世紀的時間。肝素的抗凝作用得到大家的公認，近年來，一系列臨床和基礎研究表明肝素還可以通過多種途徑調節(jié)炎癥反應。肝素抑制促炎因子的釋放，包括 IL －1β、IL －6和 TNF － α［12］。肝素抑制缺血再灌注損傷中NF－κB介導的炎癥反應，并通過增加一氧化氮和前列環(huán)素的生成減少了內皮細胞功能障礙［13］。在高動力性膿毒癥中，肝素改善內皮細胞功能和血管反應性［14］。肝素減少了內毒素鼠TNF－α和IL－1β的表達，降低中性粒細胞集聚，減少肝血管中微血栓形成和纖維蛋白(原)沉積，并降低死亡率［15］。本研究中肝素減少了LPS刺激下內皮細胞IL－8的mRNA及蛋白表達，同時減少了TLR4 mRNA的表達，提示肝素可能通過調節(jié)TLR4信號途徑發(fā)揮在膿毒癥中的抗炎作用。

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