劉成成， 祝愛珍， 周艷華， 劉革修， 何冬梅， 譚廣銷， 陳卓銘

(暨南大學(xué)1醫(yī)學(xué)院血液病研究所，2附屬第一醫(yī)院康復(fù)科，廣東廣州510632)

抗疲勞一直以來是研究的熱點(diǎn)，已有研究報(bào)道顯示，許多天然物質(zhì)可以有效緩解和抵抗疲勞，如辣椒堿，可升高血液中兒茶酚胺的濃度，延長小鼠耐力［1］;茶多酚，可促進(jìn)脂肪燃燒，降低運(yùn)動(dòng)所致的氧化應(yīng)激，緩解體力疲勞［2］;紅景天苷，通過影響運(yùn)動(dòng)過程中自由基的生成和能量代謝起到抗疲勞作用［3］。但這些物質(zhì)是否能應(yīng)用于臨床仍需進(jìn)一步研究。間充質(zhì)干細(xì)胞是一類具有多種分向潛能的細(xì)胞，作為基質(zhì)細(xì)胞中的一種，可以分泌各種細(xì)胞因子和生長因子［4］，具有自我復(fù)制、免疫調(diào)控及促進(jìn)造血干細(xì)胞植入等特點(diǎn)［5－6］，臨床上已有嘗試將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞用于重癥肌無力患者，有患者表現(xiàn)出明顯的臨床緩解，但至今沒有研究報(bào)道能解釋這一現(xiàn)象，也未有間充質(zhì)干細(xì)胞在緩解、抵抗體力疲勞方面的研究，因此，本研究目的是為了明確間充質(zhì)干細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的抗疲勞作用并探討其作用機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物 孕13.5d BALB/c小鼠4只、6月齡雌性BALB/c純系小鼠90只，SPF級(jí)，體重(20±2)g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào):(粵)2008－0002，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照中國科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒發(fā)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例執(zhí)行，在無菌條件下飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、膠原酶Ⅳ和胰蛋白酶均購自Gibco;胎牛血清購自HyClone;血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血乳酸(blood lactic acid，BLA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、肝糖原和肌糖原測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;Vevo770?高分辨率小動(dòng)物超聲系統(tǒng)購自Visual Sonics。

2 方法

2.1 MSCs的分離培養(yǎng) 引頸處死孕13.5d BALB/c小鼠，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇消毒，無菌取出胎鼠，去除胎鼠頭、尾、四肢及內(nèi)臟，PBS洗滌數(shù)次，于37℃、0.1%膠原酶Ⅳ消化獲得細(xì)胞懸液，200目篩網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞離心，PBS洗滌3次，以1×109/L密度接種于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后全量換液，棄非貼壁細(xì)胞。細(xì)胞融合達(dá)80%，用0.25%胰酶消化，按1∶3傳代;P5代細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)和成骨成脂分化鑒定。

2.2 MSCs移植 86只小鼠隨機(jī)分為3組，安靜對(duì)照(nonswimming)組18只，單純運(yùn)動(dòng)(swimming control)組34只，MSCs+運(yùn)動(dòng)(swimming+MSCs)組34只，其中MSCs運(yùn)動(dòng)組尾靜脈輸注第5代MSCs(每只5×106)進(jìn)行干預(yù)，安靜對(duì)照組和單純運(yùn)動(dòng)組輸注同體積生理鹽水1 mL。

2.3 負(fù)重游泳試驗(yàn) 單純運(yùn)動(dòng)組和MSCs運(yùn)動(dòng)組 各8只小鼠，于移植MSCs 24 h后進(jìn)行負(fù)重游泳試驗(yàn)，游泳箱水深38 cm，水溫保持在(25.0±0.5)℃，小鼠尾根部負(fù)荷5%體重的鉛皮，記錄小鼠從游泳開始至力竭的時(shí)間(即小鼠失去協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)，10 s內(nèi)沒能浮出水面的時(shí)點(diǎn))，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠取出，毛巾拭干。

2.4 血尿素氮、肝糖原、肌糖原水平及各組織中SOD活性、MDA含量的測定 安靜對(duì)照組、單純運(yùn)動(dòng)組和MSCs+運(yùn)動(dòng)組各18只小鼠，于移植MSCs 24 h后，在水深38 cm，水溫(25±0.5)℃的游泳箱里游泳60 min后，一部分小鼠用于測定各項(xiàng)生化指標(biāo)，另一部分用于檢測心功能。戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，內(nèi)眥靜脈迅速取血0.5 mL，待血液凝固后離心，測定血尿素氮的含量。取腦組織、肝臟、股四頭肌，液氮冰凍，－80℃保存，待測時(shí)按試劑盒說明書檢測肝糖原、肌糖原水平、SOD活性和MDA含量。

2.5 心功能的評(píng)估 用于檢測心功能的小鼠游泳60 min后休息30 min，Vevo770?高分辨率小動(dòng)物超聲系統(tǒng)檢測小鼠運(yùn)動(dòng)后的心臟功能，超聲測量指標(biāo)為:(1)心率(heart rate，HR);(2)每搏輸出量(stroke volume，SV)，根據(jù)主動(dòng)脈瓣血流速度－時(shí)間積分(velocity－time integral，VTIa)計(jì)算SV，計(jì)算公式為SV=VTIa×ACSA，其中ACSA為在胸骨旁長軸切面所測主動(dòng)脈瓣環(huán)水平的橫切面積;(3)心輸出量(cardiac output，CO)，指每分鐘左心室排出的血流量，即 CO=SV×HR;(4)左室舒張期容積(left ventricular diastolic volume，LVDV)。

2.6 血乳酸含量測定 單純運(yùn)動(dòng)組和MSCs+運(yùn)動(dòng)組各8只小鼠在水深38 cm，水溫(25±0.5)℃，水流8 L/min的游泳箱里游泳10 min，分別于游泳前、游泳后0、10 min尾靜脈各取血20 μL，于系統(tǒng)稀釋液中，血乳酸分析儀測定各組血乳酸的含量［7］。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 MSCs體外培養(yǎng)的生物學(xué)特點(diǎn)

原代胎鼠細(xì)胞呈梭型、多角形貼壁生長，散在、集落式分布，傳代后的細(xì)胞主要呈長梭形，形態(tài)較原代均一，呈漩渦狀生長，見圖1。第5代細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，表達(dá)CD44和CD105，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志CD34和CD45，能向成骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞分化，具備MSCs基本特點(diǎn)。成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2，可見被茜素紅染色的鈣結(jié)節(jié)。成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3，可見胞漿中有紅色脂滴。

Figure 1.Morphology of MSCs of the fifth passage(×40).圖1 第5代胎鼠MSCs形態(tài)學(xué)觀察

Figure 2.Alizarin red staining of MSCs following osteogenic induction(×200).圖2 MSCs的成骨分化

Figure 3.Oil red O staining of MSCs following adipogenic induction(×200).圖3 MSCs的成脂分化

2 實(shí)驗(yàn)小鼠一般情況觀察

移植MSCs后的小鼠變得活潑好動(dòng)，食欲略有增加，精神狀態(tài)較未移植MSCs的小鼠要好。

3 MSCs對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響

移植MSCs 24 h后，MSCs+運(yùn)動(dòng)組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間為(1 890±83)s，與單純運(yùn)動(dòng)組［(1 228±72)s］相比有所增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。這說明移植MSCs能顯著延長小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，緩解體力疲勞，提高運(yùn)動(dòng)耐力。

4 MSCs對(duì)體力疲勞小鼠各項(xiàng)生化指標(biāo)的影響

4.1 血尿素氮、肝糖原和肌糖原含量變化 小鼠進(jìn)行游泳試驗(yàn)后測定各項(xiàng)生化指標(biāo)，MSCs+運(yùn)動(dòng)組小鼠運(yùn)動(dòng)后血尿素氮明顯低于單純運(yùn)動(dòng)組，雖然較安靜對(duì)照組有所升高，但升高的幅度較小，而單純運(yùn)動(dòng)組小鼠在運(yùn)動(dòng)后血尿素氮較安靜對(duì)照組明顯升高;MSCs+運(yùn)動(dòng)組小鼠肝糖原和肌糖原含量較單純運(yùn)動(dòng)組顯著提高，而單純運(yùn)動(dòng)組小鼠在游泳實(shí)驗(yàn)后，與安靜對(duì)照組相比肝糖原和肌糖原均顯著下降，見表1，說明MSCs移植能減少小鼠機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)的氧化供能，降低血尿素氮的生成，增加肝糖原和肌糖原的合成，能源物質(zhì)儲(chǔ)備增加，則耐力運(yùn)動(dòng)更為持久。

表1 移植MSCs對(duì)體力疲勞的鼠生化指標(biāo)的影響Table 1.Effects of MSC transplantation on the levels of biochemical indexes in fatigue mice(±s.n=8)

表1 移植MSCs對(duì)體力疲勞的鼠生化指標(biāo)的影響Table 1.Effects of MSC transplantation on the levels of biochemical indexes in fatigue mice(±s.n=8)

*P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01 vs non － swimming group;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs swimming control group.

Glycogen(mg/g)Liver Muscle Non－swimming 6.41±1.65 27.49±1.74 5.12±1.09 Group BUN(mmol/L)Swimming control 11.73±1.86## 14.63±1.58## 3.34±0.96*Swimming+MSCs 7.96±1.58＊△ 24.92±1.94＊△△ 4.85±0.84△

4.2 各組織SOD活性和MDA含量 與單純運(yùn)動(dòng)組比較，MSCs+運(yùn)動(dòng)組肝臟、肌肉組織和腦組織SOD活性升高，說明移植MSCs提高了機(jī)體的抗氧化能力。單純運(yùn)動(dòng)組肝臟和肌肉組織中MDA含量較安靜對(duì)照組有所升高，但腦組織變化不明顯，說明腦組織具有一套完善的自身調(diào)控體系，而MSCs+運(yùn)動(dòng)組肝臟和肌肉組織MDA含量均較單純運(yùn)動(dòng)組低，且接近安靜對(duì)照組，見表2，說明移植MSCs能減少M(fèi)DA的生成。

表2 移植MSCs對(duì)體力疲勞的小鼠各組織MDA含量、SOD活性的影響Table 2.Effects of MSC transplantation on MDA level and SOD activity in fatigue mice(±s.n=8)

表2 移植MSCs對(duì)體力疲勞的小鼠各組織MDA含量、SOD活性的影響Table 2.Effects of MSC transplantation on MDA level and SOD activity in fatigue mice(±s.n=8)

*P ＜0.05，##P ＜0.01 vs non －swimming group;△P ＜0.05 vs swimming control group.

)］Brain Liver Muscle Brain Liver Muscle Non － swimming 1.07 ±0.24 1.89 ±0.22 1.79 ±0.23 Group MDA［μmol/(g protein )］SOD［103U/(g protein 1.35 ±0.32 4.69 ±0.89 1.15 ±0.25 Swimming control 1.13 ±0.12 3.07 ±0.26* 2.59 ±0.15* 1.87 ±0.24* 5.87 ±0.67## 1.68 ±0.17*Swimming+MSCs 1.06 ±0.20 2.15 ±0.29＊△ 1.97 ±0.23△ 1.95 ±0.19* 7.72 ±0.72＊△ 1.89 ±0.30△

5 MSCs對(duì)小鼠心功能的影響

在小鼠體力疲勞的狀態(tài)下測量心臟功能各項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果顯示MSCs運(yùn)動(dòng)組小鼠心臟室壁結(jié)構(gòu)幾乎沒有變化，但心臟輸出量、每搏輸出量、左室舒張期容積均較單純運(yùn)動(dòng)組小鼠高，心率較單純運(yùn)動(dòng)組低，說明MSCs移植能改善心功能，增強(qiáng)心臟泵血，使運(yùn)動(dòng)過程中相關(guān)組織器官血供增加，延長耐力運(yùn)動(dòng)時(shí)間，見表3。

表3 小鼠心臟超聲結(jié)果比較Table 3.Comparison of echocardiography of the mice among the 3 groups(±s.n=10)

表3 小鼠心臟超聲結(jié)果比較Table 3.Comparison of echocardiography of the mice among the 3 groups(±s.n=10)

*P ＜0.05 vs swimming control group.

Group Heart rate(min－1) Stroke volume(μL) Cardiac output(mL/min) Left ventricular diastolic volume(μL)Non － swimming 383.00 ±9.55 49.54 ±17.12 18.97±4.82 52.98 ±10.05 Swimming control 411.39 ±11.06 50.39 ±16.73 20.73 ±4.26 53.56 ±9.64 Swimming+MSCs 405.04 ±12.47 54.71 ±14.59* 22.16 ±3.25* 54.93 ±9.36*

6 MSCs對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)前后血乳酸的影響

在水流8 L/min的游泳箱里游泳10 min后，單純運(yùn)動(dòng)組小鼠血乳酸較運(yùn)動(dòng)前明顯增加，休息10 min后血乳酸水平有所下降，但仍高于運(yùn)動(dòng)前;MSCs+運(yùn)動(dòng)組小鼠運(yùn)動(dòng)后血乳酸含量也有升高，但較單純運(yùn)動(dòng)組低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，休息10 min后MSCs+運(yùn)動(dòng)組小鼠血乳酸下降明顯，接近運(yùn)動(dòng)前的數(shù)值，說明移植MSCs能減少小鼠運(yùn)動(dòng)后血乳酸的堆積，促進(jìn)乳酸分解，對(duì)延緩運(yùn)動(dòng)性疲勞具有積極作用，見表4。

表4 移植MSCs對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)過程中血乳酸的影響Table 4.Effect of MSC transplantation on blood lactic acid level in mice(mmol/L.±s.n=8)

表4 移植MSCs對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)過程中血乳酸的影響Table 4.Effect of MSC transplantation on blood lactic acid level in mice(mmol/L.±s.n=8)

#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs swimming control group.

Group Before swimming 0 min after swimming 10 min after swimming Swimming control 3.86±0.39 7.16±0.63 6.26±0.52 Swimming+MSCs 3.67±0.41 6.45±0.42# 4.37±0.43##

討 論

運(yùn)動(dòng)能力除了直接與骨骼肌功能密切相關(guān)外，還與機(jī)體心肺功能有著密切關(guān)系。心肺系統(tǒng)功能越強(qiáng)則供應(yīng)的營養(yǎng)和氧氣越多，一方面可以增加有氧代謝以最大限度滿足肌肉的能量需要，進(jìn)而減少乳酸的生成、并促進(jìn)其排出以減少堆積，另一方面則減少糖原和蛋白質(zhì)的消耗，增加肝糖原和肌糖原的儲(chǔ)備［8］，減少血清尿素氮的生成。

本研究結(jié)果不僅證實(shí)了移植胎鼠MSCs可以延長小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，緩解體力疲勞，增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)耐力，而且進(jìn)一步分析了其機(jī)制:移植MSCs明顯增強(qiáng)小鼠的心功能，同時(shí)降低血尿素氮和血乳酸水平，增加肝糖原和肌糖原儲(chǔ)備等。該研究結(jié)果可能與MSCs獨(dú)特的生物學(xué)活性有關(guān)，即MSCs不僅具有多向分化潛能，而且可分泌多種細(xì)胞因子和生長因子［9］。胎鼠間質(zhì)干細(xì)胞作為干細(xì)胞中的一種，較成體干細(xì)胞原始，具有更強(qiáng)的增殖和分化潛能，且免疫原性低，不易發(fā)生排斥反應(yīng)，能更好地發(fā)揮其作用。本課題組已有研究顯示通過移植胎鼠間充質(zhì)干細(xì)胞可以延緩機(jī)體衰老、改善心臟功能［10］，結(jié)合課題組前期報(bào)道結(jié)果，則可以進(jìn)一步解析研究中心功能增強(qiáng)的原因。目前有大量研究資料顯示，MSCs不僅可以分化為肺上皮細(xì)胞，而且可以分泌多種因子，促進(jìn)肺毛細(xì)血管的再生，這些均能改善機(jī)體肺功能［11－12］。心肺功能增強(qiáng)則為運(yùn)動(dòng)時(shí)提供了足夠的氧和能量，增加了有氧代謝，減少糖酵解的無氧代謝，增加能量的有效利用，相應(yīng)地減少了乳酸的生成、降低糖原和蛋白質(zhì)的消耗，增加肝糖原和肌糖原儲(chǔ)備，減少血尿素氮和MDA的生成，有利于維持機(jī)體機(jī)能狀態(tài)、增加其運(yùn)動(dòng)耐力。心肺功能增強(qiáng)，血液循環(huán)加快，還可以增加肝臟等重要臟器供血，增強(qiáng)肝臟合成各種能源物質(zhì)的能力，如肝糖原、肌糖原，促進(jìn)了有害代謝產(chǎn)物的分解，如血尿素氮、肌肉和肝臟的MDA、血乳酸等，同時(shí)可以減少組織細(xì)胞缺氧損傷，這些都有利于緩解體力疲勞，提高機(jī)體耐力。

移植MSCs使得小鼠心肺系統(tǒng)功能得到整體改善，機(jī)體耐力更持久。再者，有文獻(xiàn)資料顯示，移植MSCs可使得小鼠體內(nèi)SOD活性增強(qiáng)，清除氧自由基、抗氧化的能力增強(qiáng)，與本研究結(jié)果一致，這從另一個(gè)方面也緩解了體力疲勞。

總之，本研究結(jié)果為現(xiàn)今指導(dǎo)臨床上肌無力患者的治療以及緩解中老年體弱者疲勞提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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