余 飛，丁利軍

（南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院，南京 210008）

自從腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）是腫瘤發(fā)生與發(fā)展之源這一觀點被提出，人們對腫瘤有了更加深刻的認識。建立篩查腫瘤干細胞的臨床方法以及尋找以腫瘤干細胞為靶點的新藥成為腫瘤研究的新熱點。但是，目前鑒別和評價腫瘤干細胞特性的唯一工具是CSCs異種移植至免疫缺陷小鼠后的成瘤模型［1］。完善CSCs異種移植小鼠模型并利用這一模型篩選新的 CSCs是藥物篩查的前提，其需要考慮移植免疫和微環(huán)境等相關問題。本文就人CSCs異種移植模型的新進展及面臨的問題等作簡要綜述。

1 腫瘤干細胞概念

早在19世紀，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)腫瘤具有明確的組織學異質(zhì)性。1937年，F(xiàn)urth和 Kahn［2］的實驗證實來自小鼠腫瘤的單個細胞可以在受體鼠體內(nèi)誘發(fā)形成新的腫瘤。在白血病和實體瘤的研究中也發(fā)現(xiàn)能夠誘發(fā)形成腫瘤的細胞在腫瘤細胞中比率很低，僅103～107的腫瘤誘發(fā)細胞即可在受體鼠內(nèi)形成新的繼代腫瘤［3-5］。

隨后Pierce［6］的研究證實惡性畸胎瘤中含有高致瘤性細胞，這些高致瘤性細胞作為單個細胞可以分化成多個不同類型的非致瘤性細胞。在此之前，Leblond等［7-8］已結合放射自顯影技術，完成了組織內(nèi)的細胞增殖、存活期和細胞構成檢測。1971年Pierce［9］在鼠鱗狀細胞癌研究中采用這種方法獲得重要發(fā)現(xiàn)：早期，放射性標記幾乎全部出現(xiàn)在未分化區(qū)域；隨后，這些標記出現(xiàn)在分化良好區(qū)域。這證實未分化的細胞經(jīng)過衍生形成不同的分化細胞。與未分化的高致瘤性細胞不同，分化的細胞移植到合適的宿主體內(nèi)并未形成腫瘤。通過上述實驗，Pierce［10］提出了腫瘤干細胞概念：“基于發(fā)育生物學和腫瘤學規(guī)律的腫瘤概念，其本質(zhì)是組織自我更新的紊亂，它由在正常穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境下具有顯著增殖能力和有限分化能力的腫瘤干細胞以及分化的腫瘤細胞后代組成?！?/p>

CSCs概念的核心是腫瘤中并非所有的細胞都是均等的。它假定腫瘤生長與正常增生組織如骨髓、皮膚或腸上皮的生長類似，是通過能夠自我更新、數(shù)量有限的專一干細胞來實現(xiàn)的。一個腫瘤主要由快速增殖的腫瘤干細胞以及干細胞有絲分裂、分化衍生的細胞構成。分化細胞沒有自我更新能力，對腫瘤的長期維持作用可以忽略。CSCs具有正常干細胞的特征：可以自我更新，一生維持，抵御放射和化學損傷，能夠長時期休眠或是遷移至身體其他部位［11］。

2 腫瘤干細胞與腫瘤治療

由于腫瘤具有難以根治及復發(fā)率高等特點，CSCs概念自提出以來，作為抗癌戰(zhàn)略的新靶點受到關注。腫瘤細胞株的皮下移植幾十年來被廣泛應用于細胞毒素和抗增殖藥物以及復方藥物的臨床前篩選。盡管在腫瘤靶向藥物開發(fā)及靶向藥物載體研究方面取得許多進展，但經(jīng)典化療藥物在愈后不復發(fā)方面的效果有限以及能夠揭示自發(fā)腫瘤進展的細胞株不足這些都限制了腫瘤治療的進展。腫瘤干細胞概念的出現(xiàn)是一種新的模式，它為藥物發(fā)現(xiàn)和臨床前篩查提供了新的思路［12］。

與普通腫瘤細胞相比，CSCs表現(xiàn)出對細胞毒性藥物［13-15］和輻射［16］有更高的抗性。經(jīng)典的抗癌治療方法是通過優(yōu)先殺死更多的分化細胞而暫留CSCs來誘發(fā)腫瘤的快速萎縮。然而少數(shù)CSCs的存活隨后就會導致后續(xù)的腫瘤再生和疾病復發(fā)。Gleev ec等人臨床實驗的成功給腫瘤-特異性通路靶向治療提供了一個有力的證據(jù)，同時發(fā)現(xiàn)了幾種新靶向因子。CSCs的存活、自我更新和/或分化的靶向作用提示了實現(xiàn)長效根除腫瘤所需的策略。近來許多學者正在開展識別CSCs并以其作為靶向目標的研究［17，18］。此外，已證明靶向因子治療癌癥患者的療效與因子本身靶向腫瘤干細胞的能力密切相關［19］。同時，CSCs具有模仿腫瘤體內(nèi)發(fā)育的獨特能力，與腫瘤細胞株相比它是更好的臨床腫瘤模型。

3 人腫瘤干細胞異種移植模型

CSCs可以誘發(fā)體內(nèi)腫瘤，這些體內(nèi)瘤包括了原發(fā)腫瘤所有分化的細胞群，它們可以被連續(xù)移植且不損耗致瘤潛力，即 CSCs具有自我更新的潛能。目前，潛在CSCs群的篩選依賴于其在免疫缺陷動物體內(nèi)啟動腫瘤的能力。如人急性髓性白血?。ˋML）CSCs的首個證據(jù)是通過重度聯(lián)合免疫缺陷（SCID）鼠的移植實驗獲得的，其證實白血病是通過CD34+細胞而不是CD34-細胞傳遞給模型鼠的［20］。后續(xù)研究證實移植 CD34+的白血病細胞可以導致非肥胖糖尿病重度聯(lián)合免疫缺陷鼠（NOD-SCID）產(chǎn)生一系列不同分化級別的白血病細胞［21］。

實體瘤CSCs的研究由于技術原因相對滯后，主要是由于組織解離困難，膜標記物缺乏難以分離細胞核心亞群。近年來，研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌 CSCs是CD44+CD24-的核心細胞亞群，它們能夠誘發(fā)腫瘤，這些腫瘤在組織學上與乳腺脂肪墊移植患者相似［22］，而膠質(zhì)母細胞瘤的 CSCs能夠在顱內(nèi)注射后誘發(fā)腫瘤，它們表達CD133［23］。現(xiàn)在通過異種移植已經(jīng)在幾種人實體瘤內(nèi)發(fā)現(xiàn)了CSCs。人的CSC群如前列腺癌［24］，結腸癌［25］，腦癌［26］，胰腺癌［27］，肺癌［13］，卵巢癌［28］，膀胱癌［29］等均通過異種移植獲得。結腸癌 CSCs的鑒定是借助于腎被膜下移植CD133+細胞實驗完成的［30］，移植效率約比皮下移植的效率高10倍［25］。Morrison等［31，32］研究表明已分選出的一系列標記陽性和特定標記陰性的 CSC可以穩(wěn)定的復制最初的標記表達模式，即這些標記可以在腫瘤干細胞中穩(wěn)定傳遞。其研究說明，現(xiàn)有的CSC標記（表1）是顯著特異的，且異質(zhì)性表達的流式細胞技術（FACS）標記，可用于分選標記陽性和標記陰性細胞群體。

表1 常見CSCs鑒定的表面標記Tab.1 Surface markers of the CSCs

CSCs在異種移植模型中顯示了它們獨特的成瘤能力，并且這些腫瘤和患者體內(nèi)的腫瘤類似。例如結腸CSCs經(jīng)皮下移植后顯示有腺體的組成，具有伊紅染色陽性的散在細胞，這些細胞同樣可以分泌粘液［25］。腦CSCs移植后產(chǎn)生了具有扁平上皮特性的移植物，包括發(fā)育成熟的角蛋白-生成細胞［26］。CSCs異種移植模型的建立利于理解特定腫瘤干細胞的特性及制訂靶向腫瘤干細胞的治療策略。

4 異種移植模型建立的影響因素

作為判定人CSCs的金標準，分選的腫瘤干細胞異種移植到免疫缺陷鼠體內(nèi)實驗，除了操作引起的細胞應激之外，還有一系列因素制約異種移植模型的成功建立，下面在分析腫瘤干細胞異種移植模型制作程序的基礎上（圖1），詳述相關因素。

移植部位CSCs的高可塑性，決定了異種移植后成瘤特性因移植部位的變化而變化。同位和異位移植后CSCs成瘤情況的比較觀察較少。其中卵巢CSCs皮下移植和腹腔移植所產(chǎn)生的腫瘤沒有顯示出明顯的組織學差異，CSCs腹腔移植后仍產(chǎn)生血性腹水，并經(jīng)腹膜轉移至其它器官［28］。結腸 CSCs注射到結腸壁的同位移植與異位移植比較，生長的腫瘤組織學分析未顯示明顯差異。結腸移植物快速（約3周）引起肝轉移，這是皮下注射結腸CSCs后未觀察到的現(xiàn)象［25］。前列腺CSCs同位移植后觀察到轉移至包括脾、肺和肝等器官，但異位移植后未能觀察到此現(xiàn)象［24］。這些觀察說明CSCs同位移植和異位移植最重要的區(qū)別就是CSCs同位移植具有更好的復制轉移過程的能力。若研究CSCs和癌細胞轉移啟動之間的關系，必須考慮移植CSCs的部位［36］。不同于卵巢和結腸腫瘤干細胞，膠質(zhì)母細胞瘤中異位移植物具有移植位點依賴的成瘤性差異：CSCs皮下移植引起類似柵欄結構的高度血管化瘤以及組織壞死；顱內(nèi)注射膠質(zhì)母細胞瘤CSCs后顯示出其擴散和滲入腦周組織的能力［37］。通過對皮下移植物中膠質(zhì)母細胞瘤 CSCs的進一步鑒定，發(fā)現(xiàn)來源于不同患者的CSC群中部分產(chǎn)生含有軟骨和成骨細胞的混合性肉瘤［38］。這種間質(zhì)分化潛能僅在基質(zhì)微環(huán)境中顯現(xiàn)，而從未在顱內(nèi)移植中發(fā)現(xiàn)。

圖1 人腫瘤干細胞異種移植模型程序Fig.1 The operation procedure of human cancer stem cells xenograftmodel

微環(huán)境 微環(huán)境信號制約人CSCs的發(fā)生和發(fā)展。對潰瘍性結腸炎干細胞的研究發(fā)現(xiàn)成纖維細胞在調(diào)節(jié)干細胞惡性轉化方面具有關鍵作用：從一定比例病人的良性病變區(qū)分離得到的ALDH+細胞經(jīng)繼代皮下移植至鼠體內(nèi)后漸漸發(fā)展成腺癌； ALDH+細胞與來自結腸癌組織的人成纖維細胞共移植明顯提高腫瘤生長速率。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)這種過程至少部分是通過IL-6和IL-8介導的，證實在從潰瘍性結腸炎向結腸癌轉化過程中炎癥的作用［39］。含有輻照和未輻照的乳腺成纖維細胞混合物的原位“人化”鼠模型可用來反映清除乳腺脂肪墊的NOD SCID鼠允許正常乳腺干細胞發(fā)育為完全分化的乳腺組織，ALDH1為正常干細胞和乳腺癌干細胞的常用標記，可對患者臨床結局進行預測［40］并發(fā)現(xiàn)與CSCs自我更新相關的 Hedgehog信號通路［41］。通過抑制repertaxin，IL-8受體CXCR1靶向CSCs可以降低腫瘤生長和體內(nèi)轉移速率［42］。總而言之，這些研究強調(diào)了微環(huán)境因素對CSCs移植模型的影響。因此在試驗規(guī)劃及結果評估中必須考慮鼠類模型無法完全復制特異物種可溶解的、膜結合的特異細胞因子對CSCs生存的影響。

移植動物品系由于不同程度的免疫活性殘留，免疫缺陷鼠不同品系的選擇在某些情況下影響CSCs的評估。在NOD SCID IL2Rγnull鼠中黑素瘤干細胞的增長速率比NOD SCID鼠提高104倍［31］。AML的移植實驗顯示 SCID鼠中白血病-誘發(fā)細胞CD34+/CD38-群體的頻率約為 1：2.5×105，在NOD SCID中提高10～100倍［21］。研究發(fā)現(xiàn)10只PU.1-/-AML（轉錄因子 PU.1-/-急性髓細胞性白血?。┦蟮腃SCs就足夠用于移植白血病至同類動物［43］。在小鼠黑色素瘤細胞中，CD34+p75-和CD34-p75-細胞群啟動腫瘤至受體鼠，但僅有后者產(chǎn)生了異種移植物，CD34+p75-細胞進行自我更新但無分化。p75+細胞群很少表現(xiàn)出啟動腫瘤能力［44］。因此，在不同的腫瘤中，腫瘤啟動細胞的特性和頻率差異很大。

雖然異種移植至免疫缺陷鼠是CSCs研究的最基本方法，但系統(tǒng)相關問題需要仔細評估以正確的詮釋CSCs的成瘤特性。種屬特異的微環(huán)境因素和不同小鼠品系的免疫缺陷差異直接影響移植實驗結果。

5 異種移植模型存在的問題

腫瘤干細胞分選后，異種移植到免疫缺陷鼠體內(nèi)的實驗結果受到實驗操作的影響。移植干細胞在與原發(fā)腫瘤龕明顯不同的環(huán)境中發(fā)展，要在鼠組織形成克隆，必須具備強大的能力，但是沒有一個直接的證據(jù)來證明異種移植后的細胞行為確實反映了原發(fā)腫瘤內(nèi)同一細胞的分級狀態(tài)［11］。除了實驗操作誘發(fā)的細胞應激之外，還有兩個實驗限制對于異種移植來說是固有的：物種障礙和移植程序。

物種障礙可能會阻礙某些重要的龕的功能如粘附分子或生長因子與其受體間的相互作用。如通過轉鐵蛋白-轉鐵蛋白受體系統(tǒng)進行必要的鐵的傳遞，在跨越鼠-人物種屏障時效率僅為1％［45］。當通過移植鼠腫瘤細胞至完全組織相容的鼠體內(nèi)克服物種障礙時，移植物成瘤效率會得到顯著提高［46-48］。小鼠白血?。?7-49］，小鼠乳腺癌［50-52］和小鼠扁平細胞［53］的腫瘤干細胞往往可以比人腫瘤干細胞較好的優(yōu)先植入?，F(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn)，可以通過提供人生長因子［54］或人間質(zhì)元件［55］進行代償，或者是通過原位移植而不是皮下或腎被膜［56］移植來緩解。

Morrison等［57］指出：干細胞的移植可以顯示干細胞在特定實驗條件下的潛力，但不能揭示移植細胞在其原有組織或腫瘤內(nèi)的命運。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細胞移植后行為發(fā)生很大改變［58］。

現(xiàn)在還沒有直接的證據(jù)證明未經(jīng)處理的實體瘤含有CSCs。因涉及到人暴露在射線下，臨床不允許使用放射性標記技術在骨髓或白血病內(nèi)示蹤原始腫瘤干細胞或祖細胞。為了完善異種移植實驗，必須能夠顯示出原發(fā)腫瘤內(nèi) CSCs功能性的存在，這依賴找到單一、確定的 CSCs標記基因。在這些標記的基礎上，可以發(fā)展基因敲入小鼠模型或病毒標記策略進行遺傳譜系追蹤。目前，人 CSCs的原位鑒定還是空白。

總之，來自腫瘤細胞的CSCs作為干細胞可以在體外生長，而且保持在體內(nèi)產(chǎn)生異種腫瘤的能力。結腸癌和肺癌的CSCs在培養(yǎng)一年多后在異位移植后重現(xiàn)腫瘤特性［13，25］，且蛋白質(zhì)組學特性保持不變。因此特定腫瘤干細胞異種移植模型建立需要在改善腫瘤干細胞移植程序、優(yōu)化腫瘤干細胞異種移植微環(huán)境以及克服物種障礙等方面進行深入而系統(tǒng)的研究，從而為研究腫瘤發(fā)生與發(fā)展、篩選靶向腫瘤干細胞的新藥提供有力的工具，也為臨床腫瘤治療提供新的線索與路徑。

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