黃連中原小檗型生物堿的分離與鑒定Δ

王 欣1＊，武小赟2，黃彥珺2，李鐵鋼2，張 藝2，羅維早1#（1.重慶市中藥研究院，重慶 400065；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 611730）

目的：研究黃連中的原小檗型生物堿成分。方法：采用溶劑提取、色譜分離等手段對樣品進(jìn)行分離、純化，根據(jù)波譜數(shù)據(jù)進(jìn)行化合物結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果：從黃連中分離出6個生物堿成分，分別鑒定為鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸藥根堿、鹽酸非洲防己堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸巴馬汀。結(jié)論：該方法簡單、可行，可為黃連藥材及其制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供對照品。本試驗為首次采用直接分離純化的方法從黃連中得到鹽酸表小檗堿。

黃連；原小檗型生物堿；分離；鑒定；鹽酸表小檗堿

Δ國家科技支撐計劃項目（2007BAI40B03）；《中國藥典》2010版一部標(biāo)準(zhǔn)研究課題（YZ-251、YZ-252、YZ-253）

＊助理研究員，碩士。研究方向：中藥化學(xué)。電話：023-89029031。E-mail：wangxin_cq386@sina.com

#通訊作者：研究員。研究方向：中藥化學(xué)及新劑型。電話：023-89029026。E-mai:loweizao@163.com

黃連始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，系毛茛科植物黃連Coptis chinensisFranch.、三角葉黃連C.deltoideaC.Y.Cheng etHsiao或云連C.teetaWall.的干燥根莖。其化學(xué)成分主要為異喹啉類生物堿，其中小檗堿含量最高；其次為黃連堿、巴馬汀、藥根堿、木蘭堿、表小檗堿、甲基黃連堿、非洲防己堿等；此外，還含有阿魏酸、綠原酸、3，4-二羥基苯乙醇葡萄糖苷等酚性成分和鉀、磷、鎂、鈉等多種無機(jī)元素及多糖成分[1、2]。

黃連中生物堿均為異喹啉類生物堿，其化學(xué)結(jié)構(gòu)母核相同，僅母核上取代基不同，結(jié)構(gòu)差異極小，理化性質(zhì)也極其相似，分離純化難度極大；尤其是表小檗堿、黃連堿、非洲防己堿純品制備難度大，對照品奇缺。小檗堿雖是黃連的活性成分之一，但在黃柏、三棵針、十大功勞、唐松草等植物中都存在，故僅以小檗堿作為黃連藥材、飲片及其制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)成分，客觀性和專屬性較差；而生物堿是黃連的有效成分，除小檗堿之外，黃連藥材中還有一些含量相對較高的成分，如黃連堿、巴馬亭、藥根堿、表小檗堿等，特別是黃連堿和表小檗堿可作為甄別黃連與其他摻假品的指標(biāo)性成分。李信炯等[3]采用碘化物衍生化法從黃連中分離得到表小檗堿碘化物，未直接得到表小檗堿；而筆者首次采用直接分離純化的方法從黃連中得到了鹽酸表小檗堿。本試驗旨在對黃連中幾種主要生物堿（見圖1）的分離、純化方法進(jìn)行研究，得到各生物堿單體，為黃連藥材及其制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供對照品[4～6]。

圖1 黃連中主要生物堿結(jié)構(gòu)Fig 1 Structure ofmain alkaloids from Rhizoma Coptidis

1 儀器與試藥

Melting Point B-540型熔點儀（瑞士Buchi公司）；Mercury Plus-400型核磁共振譜儀（美國Varian公司，TMS為內(nèi)標(biāo)）；AutoSpec 3000型質(zhì)譜儀（美國VG公司）；FTIR-8700型紅外光譜儀（日本Shimadzu公司）。

反相C18硅膠填料（60μm，日本DAISO公司）；預(yù)制硅膠板（青島譜科分離材料有限公司）；所用試劑均為分析純。黃連藥材于2007年10月購于重慶石柱，經(jīng)重慶市中藥研究院鐘國躍研究員鑒定為毛茛科植物黃連C.chinensisFranch.的干燥根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取與分離

取黃連根莖粗粉（干重15 kg），依次用8～10倍95%乙醇、60%乙醇、30%乙醇、0.5%硫酸水溶液滲漉，分別減壓回收乙醇，濃縮至適量，合并濃縮液，用熱水溶解，80℃保溫，鹽酸調(diào)pH值至2～3，放置過夜。過濾后得母液A，加入活性炭于80℃保溫30℃后脫色、過濾，備用；沉淀A用95%乙醇溶解，加入活性炭于80℃保溫30m in，趁熱過濾，得沉淀A重結(jié)晶液，適量濃縮，90℃保溫30m in，趁熱抽濾，抽濾后的液體為母液B，不溶物為沉淀B。母液B用95%乙醇重結(jié)晶，得結(jié)晶1；沉淀B用50%乙腈重結(jié)晶，得結(jié)晶2；母液A脫色液與母液B及沉淀B的去結(jié)晶后的母液B合并。合并液揮盡有機(jī)溶劑，濃縮至適量，用石灰乳調(diào)pH值至9，80℃保溫30m in，趁熱抽濾，濾液用鹽酸調(diào)pH值至5～6，濃縮至適量，上D101型大孔樹脂柱，依次用水、20%乙醇、40%乙醇洗脫，合并乙醇洗脫液，減壓回收至無醇味，適量水溶解分散，上C18反相硅膠柱，用乙腈-水（0.5∶9.5→9∶1）梯度洗脫，反復(fù)層析，按色帶收集洗脫液，用50%乙腈和95%乙醇反復(fù)重結(jié)晶，分別得結(jié)晶1（850.93 g）、2（111.88 g）、3（12.24 g）、4（14.88 g）、5（34.32 g）、6（80.60 g）。黃連生物堿的提取分離流程見圖2。

圖2 黃連生物堿的提取分離流程Fig 2 Extraction and isolation processof alkaloids from Rhizoma Coptidis

2.2 生物堿的鑒定

結(jié)晶1：淡黃色針狀結(jié)晶，易溶于熱水，微溶于冷水、冷乙醇，幾乎不溶于氯仿和乙醚；熔點：204.8～205.4℃；UVλCH3OHmax：350，265，229 nm；IR｛KBrmax（cm－1）：3 402，2 997，1 504，1 363；1H-NMR（CD3OD）δ：3.30（2H，t，J＝6.3 Hz，H-2），4.08（3H，s，H-20，OCH3），4.19（3H，s，H-19，CH3），4.85（2H，t，J＝15.4 Hz，H-1），6.08（2H，s，H-15），6.93-9.75（6H，Ar-H）；FAB-MS（m/z）：336 [M]+；采用高效液相色譜（HPLC）法檢測純度＞98%。

結(jié)晶2：橙黃色針狀結(jié)晶，極難溶于水，微溶于乙醇、甲醇；290℃完全炭化，400℃也不熔；UVλCH3OHmax：360，265，241 nm；IR｛KBrmax（cm－1）：3 365，3 004，1 604，1 323；1H-NMR（CD3OD）δ： 3.25（2H，brs，C6H2），4.89（2H，br s，C5H2），6.10（2H，s，C2，3-OCH2O-），6.46（2H，s，C9，10-OCH2O-），6.95（1H，s，C4H），7.64（1H，s，C1H），7.87（2H，s，C11，12H），8.73（1H，s，C13H），9.72（1H，s，C8H）；FAB-MS（m/z）：320[M]+；采用HPLC法檢測純度＞98%。

結(jié)晶3：橙色針狀結(jié)晶，溶于水、乙醇、甲醇，不溶于氯仿；熔點：212.2～212.9℃；UVλCH3OHmax：350，265，239 nm；IR｛KBrmax（cm－1）：3 734，3 341，1 634，1 533，1 444，1 361；1H-NMR（CD3OD）δ：3.20（2H，t，J＝6.3 Hz，H-2），4.88（2H，m，H-1），6.84（1H，s，H-3），7.63（1H，s，H-6），7.98（1H，d，J＝9.15 Hz，H-8），8.07（1H，d，J＝9.2 Hz，H-9），8.76（1H，s，H-7），9.72（1H，s，H-12）；FAB-MS（m/z）：338[M]+；采用HPLC法檢測純度＞98%。

結(jié)晶4：橙黃色結(jié)晶粉末，溶于水、乙醇、甲醇，不溶于氯仿；熔點：243.1～244.0℃；UVλCH3OHmax：227，266，349，430 nm； IR｛KmBaxr（cm－1）：3 390，1 635，1 605，1 564，1 508；1H-NMR（CD3OD）δ：9.74（1H，s，H-8），8.63（1H，s，H-13），8.08（1H，d，J＝9.0 Hz，H-11），8.00（1H，d，J＝9.2 Hz，H-12），7.55（1H，s，H-1），7.01（1H，s，H-4），4.92（2H，t，J＝6.0 Hz，H-6），4.20（3H，s，9-OCH3），4.10（3H，s，10-OCH3），3.96（3H，s，2-OCH3），3.30（2H，t，J＝6.0Hz，H-5）；FAB-MS（m/z）：338[M]+；采用HPLC法檢測純度＞98%。

結(jié)晶5：橙紅色針狀結(jié)晶，溶于水、乙醇、甲醇，不溶于氯仿；熔點：266.0～267.5℃；UVλCmHa3xOH：359，265，243 nm；IR｛KmBaxr（cm－1）：3 327，2 929，1 604，1 359；1H-NMR（CD3OD）δ：3.30（2H，t，J＝6.3 Hz，H-2），3.94（2H，t，J＝15.4 Hz，H-1），4.88（2H，s，H-15），6.46～9.71（6H，Ar-H）；FAB-MS（m/z）：336[M]+；采用HPLC法檢測純度＞98%。

結(jié)晶6：黃色針晶（95%乙醇重結(jié)晶），溶于冷水，易溶于熱水，微溶于乙醇，幾乎不溶于氯仿和乙醚；熔點：208.0～208.8℃；UVλCmHa3xOH：348，266，227 nm；IR｛KmBa（xrcm－1）：3 647，3 354（-OH），1 605，1 510，1 458，1 364；1H-NMR（CD3OD）δ：3.27（2H，m，H-2），4.93（2H，t，J＝6.3 Hz，H-1），7.03（1H，s，H-3），7.62（1H，s，H-6），8.01（1H，d，J＝9.2 Hz，H-8），8.09（1H，s，J＝9.2 Hz，H-9），8.79（1H，s，H-7），9.75（1H，s，H-12）；FAB-MS（m/z）：352 [M]+；采用HPLC法檢測純度＞98%。

將波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道[7～11]數(shù)據(jù)相比較，可知結(jié)晶1、2、3、4、5、6依次為鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸藥根堿、鹽酸非洲防己堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸巴馬汀。

3 討論

用95%乙醇、60%乙醇、30%乙醇、酸水梯度滲漉，可使黃連中的生物堿提取充分。其中，酸水選擇用0.5%的硫酸水溶液，使小檗堿轉(zhuǎn)變成硫酸鹽而溶出，但硫酸水溶液濃度不易過高，否則會導(dǎo)致小檗堿硫酸鹽轉(zhuǎn)化為硫酸氫鹽，反而降低小檗堿的收率[12]。再用鹽酸調(diào)節(jié)pH值，使硫酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)辂}酸鹽，降低了溶解度，使小檗堿容易析出。小檗堿具有α-羥胺結(jié)構(gòu)，能形成醇胺型、季銨型、醛型3種互變結(jié)構(gòu)，其中季銨型小檗堿最穩(wěn)定，在水中溶解度最大。若堿性過強(qiáng)，季銨型小檗堿將轉(zhuǎn)變?yōu)榇及沸突蛉┬托￠迚A，而醇胺型或醛型小檗堿的親脂性強(qiáng)，難溶于水。當(dāng)石灰乳調(diào)pH值過高時，就會造成小檗堿由季銨型轉(zhuǎn)變成醇胺型或醛型分子，降低其提取率。因此，石灰乳調(diào)pH值是除雜的關(guān)鍵點。黃連中的水溶性雜質(zhì)黏度大，妨礙生物堿的結(jié)晶，應(yīng)除去，而采用D101型大孔樹脂能除去黃連中的水溶性雜質(zhì)。

本研究首次使用C18反相硅膠柱進(jìn)行黃連生物堿的分離，主要是考慮到季胺型生物堿極性大，正相硅膠層析柱載樣量小，難分離。試驗結(jié)果表明，C18反相硅膠柱分離效果較好，但仍需多次分離，若上樣量和洗脫梯度控制恰當(dāng)，能達(dá)到較理想的分離效果。

通過HPLC法測定本試驗得到的鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸藥根堿、鹽酸非洲防己堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸巴馬汀的純度，用歸一化法計算得純度均達(dá)到98%以上，可作為黃連藥材及其制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的對照品。

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Study on Isolation and Identification ofA lkaloidsof Protoberberine from Rhizoma Coptidis

WANG Xin，LUOWei-zao（Chongqing Academy of Chinese Materia Medica，Chongqing 400065，China）
WU Xiao-yun，HUANG Yan-jun，LITie-gang，ZHANG Yi（Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611730，China）

OBJECTIVE：To study the alkaloids of protoberberine from Rhizoma Coptidis.METHODS：Samples were isolated and purified by means of solvent extraction and column chromatography，and their structures were identified by spectral analyses. RESULTS：Six alkaloids were isolated and identified.The alkaloids were berberine hydrochloride，coptisine hydrochloride，jatrorrhizine hydrochloride，columbam ine hydrochloride，epiberberine hydrochloride，and palmatine hydrochloride.CONCLUSION：The method is simple and feasible，and can provide standards for studying medicinal herbs of Rhizoma Coptidis and its preparations. Epiberberine hydrochloride and directly isolated from Rhizoma Coptidis for the first time.

Rhizoma Coptidis；A lkaloids of protoberberine；Isolation；Identification；Epiberberine hydrochloride

R284.1；R284.2

A

1001-0408（2012）23-2149-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.23.14

2011-06-12

2011-12-30）