楊凌，蔡哲，周忠蜀，潘琳，舒峻，張可華，楊煜光，李鴻

(1.新世紀(jì)婦兒醫(yī)院，北京 100102;2.衛(wèi)生部中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，北京 100029;3.衛(wèi)生部中日友好醫(yī)院兒科，北京 100029;4.衛(wèi)生部中日友好醫(yī)院心血管外科，北京 100029)

低氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是指新生兒圍生期窒息導(dǎo)致的低氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain injury，HIBI)，是導(dǎo)致新生兒死亡和兒童神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的主要原因之一，因此一直受到圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)及神經(jīng)科學(xué)工作者的廣泛重視。動物實驗研究中常以HIBI 新生動物作為研究對象，其模型種類較多，其中最為經(jīng)典的是Rice 法，采用7 日齡新生大鼠單側(cè)頸動脈結(jié)扎后暴露于低氧環(huán)境下制作而成。本實驗在傳統(tǒng)制模過程中省去了麻醉步驟和動物手術(shù)后休息時間［1］，對新生大鼠進(jìn)行HIBI 模型制作，觀察大鼠體重增長變化、行為能力表現(xiàn)及腦組織病理形態(tài)改變;通過比較HIBI 制模后3 d、14 d 腦均漿beta-NGF 和human-NT3 的變化探討低氧缺血對神經(jīng)營養(yǎng)因子的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

1.1.1 常壓低氧艙

自制，20 cm ×30 cm ×40 cm 有機(jī)玻璃艙，有兩處空隙與外界相通(一側(cè)通氧氮混合氣，另一側(cè)與測氧儀相接)，底層鋪有鋸末以吸收CO2及濕氣。

1.1.2 測氧儀

杭州梅城電化分析儀器廠CY-12C 型便攜式數(shù)字測氧儀，測氧范圍0%～100%。

1.1.3 電子天平

Gottingen Germany 公司Sartorius GMBH R200D型。

1.2 實驗動物和分組

7 日齡新生Sprague-Dsawley(SD)大鼠32 只，來源于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心【SCXK-(軍)2007-004】，雌雄不拘，體重12～14 g，SD 大鼠飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院動物實驗室【SYXK-(京)2010-0011】，飼養(yǎng)環(huán)境符合國標(biāo)GB14925-2001。實驗經(jīng)中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究實驗動物倫理委員會審核批準(zhǔn)，符合中國動物實驗的福利倫理準(zhǔn)則，并按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。SD 大鼠隨機(jī)分為3 組:(1)空白對照組(n =5)，不做任何處理;(2)假手術(shù)組(n =8)，分離左側(cè)頸總動脈后直接縫合皮膚，未予結(jié)扎及入低氧艙;(3)HIBI 模型組(n =19)。

1.3 改進(jìn)的Rice 法模型制作

已經(jīng)編號的7 日齡S-D 新生大鼠，術(shù)前稱重及編號，仰臥位下，用膠帶固定四肢，75%乙醇消毒皮膚，解剖顯微鏡下行頸部正中切口，胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)分離出左頸總動脈并用5-0 號滅菌絲線雙線結(jié)扎，縫合傷口并再次消毒皮膚。整個手術(shù)過程在15 min內(nèi)完成。手術(shù)后立即將大鼠置于自制的玻璃艙內(nèi)，輸入氧氮混合氣。測氧儀監(jiān)測氧濃度為8%，缺氧倉置于恒溫水浴箱中，艙內(nèi)溫度控制在37～37.5℃，濕度為70% ±5%，缺氧時間持續(xù)4 h。實驗結(jié)束后將大鼠放回鼠籠由母鼠行母乳喂養(yǎng)。每只模型鼠在缺氧過程都獨立計時。新生大鼠均由母鼠母乳喂養(yǎng)，21 日齡時斷奶，雌雄分籠。予以清潔飲食飲水，室溫維持在22℃，予以12 h 光照、12 h 黑暗。

1.4 行為觀察及體重測定

HIBI 模型組大鼠離開缺氧艙后立即按照神經(jīng)功能缺損評分分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分，神經(jīng)功能缺損評分為1～3 分者提示HIBI 制模成功(表1)。于制模當(dāng)日(d0)、制模后第3 天(d3)、第7 天(d7)、第10天(d10)觀察每只大鼠的行為能力，包括平地爬行、平衡能力、患側(cè)肢體活動情況以及有無異常運動、抽搐等。于d0、d3、d7、d10 上午8～10 時測定每只大鼠體重，計算各時間點體重增長率，觀察體重增長情況。體重增長率=(dn 體重－d0 體重)/d0 體重。

1.5 腦組織取材、固定及石蠟切片制作

于d10，部分大鼠乙醚麻醉后，開胸后經(jīng)心臟用肝素化生理鹽水灌注50～250 mL，然后用4%多聚甲醛溶液灌注50～250 mL。灌注后斷頭取出腦組織，用4%多聚甲醛溶液過夜固定。腦組織沿視交叉和乳頭體中部為切面行冠狀切片，常規(guī)制成石蠟包埋切片，片厚6 μm。

1.6 HE 染色及焦油紫染色

腦組織石蠟切片經(jīng)二甲苯及乙醇濃度梯度脫蠟入水，用蒸餾水沖去殘留成分;Mayer 蘇木精染色10 min，自來水漂洗，去浮色，以1% 鹽酸乙醇分色數(shù)秒，自來水藍(lán)化1～2 h，0.5%伊紅水溶液復(fù)染2～5 min，光鏡下顏色滿意后經(jīng)漂洗去除伊紅浮色;乙醇脫水，二甲苯透明石蠟切片，中性樹膠封片。石蠟切片入0.1%焦油紫37℃40 min;自來水洗2 min 后95%乙醇鏡下控制分色至尼氏小體顆粒;梯度乙醇脫水后二甲苯透明石蠟切片，中性樹膠封片。觀察HIBI 腦組織細(xì)胞形態(tài)改變及神經(jīng)元尼氏小體。

1.7 比較d3、d14 假手術(shù)組和HIBI 組腦勻漿beta-NGF 和human-NT3

1.7.1 樣本收集及蛋白提取

部分大鼠分別于d3、d14 用乙醚麻醉后，斷頭取腦，加入500 μL 組織裂解液，冰上用勻漿器勻漿后裂解30 min，組織液離心4℃，30 min。取上清，樣品保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2 ELISA 試劑盒(R＆D Systems)

96 孔板過夜包被后，采用抗體夾心法檢測腦勻漿特異蛋白。通過顯色反應(yīng)及酶標(biāo)儀在450 nm 波長下測定吸光度(A 值)，計算樣品濃度，定量檢測兩種神經(jīng)營養(yǎng)因子。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 10.0 軟件進(jìn)行分析，所得計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，計量資料比較應(yīng)用單因素方差分析和獨立t 檢驗，計數(shù)資料比較應(yīng)用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 體重增長情況

HIBI 模型組d3、d7 及d10 體重增長率與空白對照組和假手術(shù)組比較均有顯著差異(P＜0.01)(圖1)。

2.2 行為觀察

實驗前各組新生大鼠行為能力正常，HIBI 模型組大鼠的行為異常在低氧過程中表現(xiàn)最為明顯，進(jìn)入低氧玻璃艙后5～10 min 后有的動物躁動不安，低氧15 min 后全部大鼠皮膚出現(xiàn)蒼白、呼吸淺慢，30～45 min 后活動明顯減少，肌肉顫動和(或)頭顫(12/19)、翻身不能(16/19)、甚至抽搐(8/19)等，與意識障礙(如嗜睡、易激惹)交替出現(xiàn)，4 只大鼠于低氧艙內(nèi)或出艙后死亡，死亡率為21%。離開低氧艙后，10 只大鼠平地爬行時出現(xiàn)右后肢拖步(10/19);出現(xiàn)的異常運動包括不動、凝視、顫抖、豎毛(10/19)和肌肉緊張、易激惹(6/19);未見自發(fā)或夾尾左旋。HIBI 模型組全部大鼠按照神經(jīng)功能缺損評分分級均符合HIBI 造模成功標(biāo)準(zhǔn)，其中4 只意識喪失后死亡(4 分);5 只爬行時向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈(2 分);10只右側(cè)前爪不能完全伸展或右后肢行走時拖步(1分)。HIBI 模型組于制模后3 d，僅4 只(4/15)仍有右后肢拖步爬行;3 只存在不動、肌肉緊張的異常運動，行為障礙和異常運動的發(fā)生率分別為27% 和20%，與制模當(dāng)日無顯著改善。

圖1 各組大鼠體重增長率的比較Note:The body weight increase ratio of HIBI group was significantly lower compared with the control group and sham operated group(＊＊P＜0.01).Fig.1 Comparison of the body weight increase ratio of rats in the two groups

圖2 新生7 日齡SD 大鼠假手術(shù)組d7 腦組織病理形態(tài)Note: A: Histology of the hippocampus CA2 region(Scale bar = 500 μm);B: Neurons are regularly arranged in the hippocampi CA2 region(Scale bar = 50 μm)Fig.2 Histological appearance of the brain of 7-day-old neonatal SD rats in the sham-operated group

2.3 病理觀察

本實驗HE 及焦油紫染色光鏡下觀察，空白對照組和假手術(shù)組左、右腦病理結(jié)果無明顯異常(圖2，彩插8)。HIBI 病變主要集中在左側(cè)皮質(zhì)和海馬區(qū)CA2、CA3 區(qū)。皮質(zhì)、海馬CA2 區(qū)神經(jīng)元排列紊亂，部分細(xì)胞深染(圖3A);腦組織間質(zhì)疏松水腫，微血管及毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血(圖3B、2C);神經(jīng)元數(shù)目減少，小膠質(zhì)細(xì)胞增多，血管擴(kuò)張;假手術(shù)組皮層區(qū)神經(jīng)元內(nèi)可見清晰的尼氏小體分布(圖3D)，HIBI 神經(jīng)元內(nèi)尼氏小體數(shù)目減少，神經(jīng)元固縮、深染，尼氏小體不清晰(圖3E、3F)(彩3 見彩插9。)。

圖3 新生7 日齡SD 大鼠HIBI 制模后7d 腦組織病理改變形態(tài)Note: A: Disarranged neurons and some were darkly stained.(Scale bar = 50 um).B: The cerebral architecture was loosen and swollen, with dilated and congested microvessels and capillaries(Scale bar = 50 um).C: The number of neurons was reduced and that of microglial cells was increased(Scale bar = 50 um).D: Nissl substance was clearly visible in the cortical neurons of the sham-operated group rats(under oil immersion lens).E: The amount of Nissl substance was reduced in neurons(under oil immersion lens).F: Neurons showing pycnosis, dark staining, and unclear Nissl substance(under oil immersion lens).Fig.3 Histopathological changes of the HIBI group SD rats on day 7

2.4 HIBI 后腦勻漿human-NT3、β-NGF 含量變化

HIBI 后3 d(d3)腦勻漿human-NT3 較假手術(shù)組顯著增加(P＜0.01)，制模后14 d(d14)human-NT3 表達(dá)較假手術(shù)組顯著降低(P＜0.01);HIBI 組d14 的β-NGF 表達(dá)較假手術(shù)組顯著降低(P＜0.05)(圖4，5)。

圖4 新生大鼠HIBI 制模后腦均漿human-NT3 變化(＊＊P＜0.01)Fig.4 Change of the concentration of human-NT3 in brain homogenate of the HIBI group rats

圖5 新生大鼠HIBI 制模后腦均漿β-NGF 變化(*P＜0.05)Fig.5 Changes of the concentration of β-NGF in brain homogenate of the HIBI group rats

3 討論

新生大鼠HIBI 模型為HIBI 的保護(hù)研究和行為學(xué)評估提供了可靠的實驗方法。7 日齡大鼠處于腦發(fā)育的高峰期，此時缺氧缺血造成的腦損傷與圍產(chǎn)期窒息造成的足月兒腦損傷相似［2-3］。本實驗中新生大鼠在非麻醉狀態(tài)下進(jìn)行手術(shù)，使術(shù)后動物能保持足夠的活力耐受下面的缺氧過程，大鼠手術(shù)后立即進(jìn)入低氧艙，省去了低氧缺血間期，更符合圍產(chǎn)期低氧缺血的自然病程。

新生兒HIBI 部位、范圍和嚴(yán)重程度與成熟度、低氧缺血(hypoxic-ischemia，HI)的程度有關(guān)［4-5］，輕微的低氧缺血一般影響大腦皮質(zhì)和海馬的神經(jīng)細(xì)胞［3］，而窒息時間長、反復(fù)的陣發(fā)性HI 可引起紋狀體損害。HIBI 組HE 染色顯示多在缺血側(cè)大腦造成損害，呈半球性低氧缺血性腦損傷病變，結(jié)扎側(cè)大腦半球神經(jīng)元死亡、神經(jīng)細(xì)胞變性及膠質(zhì)細(xì)胞增生，尤以海馬區(qū)CA2 區(qū)明顯;實驗中采用Nissl 染色來評價缺氧缺血對神經(jīng)元的損傷，HIBI 神經(jīng)元內(nèi)尼氏小體數(shù)目減少，神經(jīng)元固縮、深染，尼氏小體不清晰。

HI 所致皮質(zhì)損傷可導(dǎo)致感覺運動功能受損;紋狀體損傷會引起近期自發(fā)運動改變;海馬損傷可導(dǎo)致空間記憶和學(xué)習(xí)能力下降。體重增長率是一種非常簡便、客觀的檢測指標(biāo)，反映新生動物的全面健康狀況，術(shù)后l d 的體重改變主要受手術(shù)應(yīng)激影響，而術(shù)后3～10 d 的體重指數(shù)與神經(jīng)功能缺損程度有關(guān)。HIBI 模型組大鼠體重增長緩慢，d3、d7 和d10的體重增長率明顯降低，與假手術(shù)組比較有顯著差異。體重增長率降低的主要原因為主動覓食行為減少，而手術(shù)過程中未傷及頸部神經(jīng)分支或與咀嚼、吞咽功能有關(guān)的肌肉，故動物覓食行為減少為HIBI 后導(dǎo)致的運動功能障礙所致。本實驗中HIBI 組d3 大鼠的行為障礙和異常較前明顯減少，考慮可能與HI能促使新生大鼠皮質(zhì)及海馬的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增生、神經(jīng)營養(yǎng)因子參與自身修復(fù)有關(guān)。神經(jīng)營養(yǎng)因子［6，7，8］是HIBI 發(fā)生后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)賴以增殖、遷移和分化，拯救神經(jīng)元、促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)微環(huán)境中的重要組成部分。本研究中d3 腦勻漿human-NT3 表達(dá)增加而β-NGF 較假手術(shù)組無明顯變化，推測兩種神經(jīng)營養(yǎng)因子可能在早期HIBI 參與了神經(jīng)功能保護(hù)機(jī)制，而于d14 這種效應(yīng)逐漸消退，神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)顯著減少，考慮可能與HI 所致神經(jīng)細(xì)胞凋亡及不可逆損傷有關(guān)。

(本文圖2 見彩插8，圖3 見彩插9。)

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