俞發(fā)榮，連秀珍，謝明仁，張紅梅，李立新，張琛，李世平

(甘肅省證據(jù)科學(xué)技術(shù)研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070)

目前，國內(nèi)外對海洛因成癮機(jī)制的研究主要集中在鑒別和診斷成癮的事件相關(guān)電位(ERP)成分、成癮導(dǎo)致認(rèn)知障礙或缺失的腦機(jī)制以及成癮的生理心理機(jī)制等三個方面。分子學(xué)研究結(jié)果表明，海洛因作為胞外信息信號分子(“第一信使”)與伏隔核［1-4］和中腦腹側(cè)被蓋區(qū)相應(yīng)受體結(jié)合后，通過G蛋白介導(dǎo)作用激活腺苷酸環(huán)化酶、鳥苷酸環(huán)化酶，產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)“第二信使”，如:cAMP、cGMP、Ca2+等，第二信使引起細(xì)胞瞬時反應(yīng)的同時，還可激活核內(nèi)第三信使，引起基因轉(zhuǎn)錄水平的改變，進(jìn)一步誘發(fā)細(xì)胞表型發(fā)生變化。在以阿片受體為主要研究靶部位的同時，開展了大量與成癮有關(guān)的神經(jīng)核和神經(jīng)回路的研究;在以內(nèi)源性阿片肽為主要研究遞質(zhì)系統(tǒng)的同時，對膽堿能系統(tǒng)、垂體-腎上腺-性腺系統(tǒng)和甲狀腺系統(tǒng)等內(nèi)分泌系統(tǒng)以及細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能和各種非特異性免疫功能方面［5］開展了研究。但對海洛因的神經(jīng)毒性作用的研究報(bào)道較少。本文將海洛因給予Wistar 大鼠，建立海洛因成癮動物模型，探索海洛因?qū)ι窠?jīng)系統(tǒng)的毒性作用，為臨床戒毒提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF 級Wistar 大鼠20 只，雄性，體重200～210g，購于甘肅省中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心【SCXK(甘)2011-0001】。

Bax 檢測試劑盒:購于上海滬峰生物科技有限公司。海洛因:含量為86.8%，甘肅省公安廳提供。鹽酸納洛酮:辰欣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號:120214902。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組

20 只SPF 級Wistar 大鼠飼養(yǎng)【SYXK(甘)2010-0002】適應(yīng)7 d。第8 天，將Wistar 大鼠隨機(jī)分為A、B 兩組。A 組:給予等量生理鹽水(im)，作為對照;B 組:給予海洛因建立成癮動物模型(第1 次，給予海洛因10 mg/kg(im)，每天1 次;從第2 次開始，每次增加10 mg/kg，連續(xù)7 d。第8 天腹腔注射納洛酮6.0 mg/kg，觀察戒斷癥狀。

1.2.2 切片制作

實(shí)驗(yàn)第9 天，大鼠用乙醚吸入麻醉，手術(shù)暴露心臟，從左心室注入0.9%NaCl 100 mL，隨即吊滴4 %甲醛PBS 液(pH 7.4)300 mL 固定，即刻解剖出大腦，參照大鼠腦立體定位圖譜［6］，選取大鼠中腦腹側(cè)被蓋區(qū)，酒精(30%、50%、70%、80%、90%、95%、100% ×2)脫水，石蠟包埋、切片，片厚為5 μm。切片貼于干凈載玻片上，備用。

1.2.3 Bax 表達(dá)檢測

按說明書方法操作，光鏡觀察，顯微拍照并進(jìn)行圖像分析。

1.2.4 圖像分析

切片的IOD(積分吸光度:所測結(jié)構(gòu)范圍內(nèi)各像素光密度值之和)和MAJ(平均吸光度:所測結(jié)構(gòu)的截面內(nèi)各像素的光密度值的算術(shù)平均)，用YA-G5000系列醫(yī)學(xué)細(xì)胞影像分析軟件進(jìn)行圖像處理分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，以P＜0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成癮大鼠的行為觀察

給予鹽酸納洛酮1h 后，B 組(海洛因組)大鼠出現(xiàn)明顯的戒斷反應(yīng)癥狀，各癥狀所出現(xiàn)的次數(shù)計(jì)分與A 組(對照組)比較差異有顯著性(P＜0.01)，結(jié)果見圖1。

圖1 大鼠海洛因成癮戒斷癥狀Note:＊＊P＜0.01 vs control groupFig.1 Heroin addiction withdrawal symptoms of the rats

2.2 大鼠中腦腹側(cè)被蓋區(qū)Bax 的表達(dá)

光鏡下:B 組大鼠中腦腹側(cè)被蓋區(qū)切片中Bax表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)比A 組顯著增多。見圖2，3(彩插8)。

圖像分析發(fā)現(xiàn):B 組中腦腹側(cè)被蓋區(qū)組織細(xì)胞中IOD、MA 均高于A 組，與A 組比較差異有顯著性(P＜0.01)，結(jié)果見表1。

表1 海洛因?qū)χ心X腹側(cè)被蓋區(qū)Bax 表達(dá)的影響(±s，n =10)Tab.1 Effect of heroin on Bax expression in VTA

表1 海洛因?qū)χ心X腹側(cè)被蓋區(qū)Bax 表達(dá)的影響(±s，n =10)Tab.1 Effect of heroin on Bax expression in VTA

注:與對照組比:＊＊P＜0.01。Note:＊＊P＜0.01 vs control group.

組別groupIODMA A(對照)組A control group5.6 ±0.40.140 ±0.006 B(海洛因)組B heroin group9.3 ±0.1＊＊0.236 ±0.007＊＊

圖2 A 組中腦腹側(cè)被蓋區(qū)Fig.2 Group A.The ventral tegmental area.

圖3 B 組中腦腹側(cè)被蓋區(qū)Bax 表達(dá)Fig.3 Group B.Bax expression in the ventral tegnental area.

3 討論

Bax 基因是一種促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因，屬于Bcl-2 家族［7］。人類 Bax 基因定位于染色體19q13.3～19q13.4，含6 個外顯子，其C 端含有疏水氨基酸組成的跨膜結(jié)構(gòu)域。在腫瘤患者體內(nèi)bax 表達(dá)較低［8］，對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用較弱。Bax蛋白為整合膜蛋白［9］，在Bax 作用下，線粒體跨膜電位降低，細(xì)胞線粒體內(nèi)外膜之間的通透性轉(zhuǎn)換孔(PTP)開放，導(dǎo)致線粒體膜通透性增大，使細(xì)胞凋亡的啟動因子如:細(xì)胞色素c(cytochrome c，Cyt c)、凋亡蛋白酶激活因子(Apaf)和凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)等從線粒體內(nèi)釋放出來。細(xì)胞色素c 和Apaf 相互作用可激活caspase-9，進(jìn)而激活caspase-3。Caspase3是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，被譽(yù)為死亡蛋白酶，其上調(diào)表明凋亡通路被激活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)多巴胺神經(jīng)元的損傷被認(rèn)為是阿片類物質(zhì)引起精神依賴及戒斷癥狀的主要根源［10］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予海洛因后，大鼠中腦腹側(cè)被蓋區(qū)組織細(xì)胞中Bax 表達(dá)顯著增強(qiáng)，與對照組比有顯著性差異(P＜0.01)。Bax 表達(dá)增強(qiáng)，提示線粒體凋亡通路激活，中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)多巴胺神經(jīng)元對凋亡信號的反應(yīng)增強(qiáng)，損傷的細(xì)胞增多，從而出現(xiàn)海洛因精神依賴及戒斷癥狀。

(本文圖2，3 見彩插8。)

［1］張新勇，潘貴書，徐國強(qiáng).毀損海洛因依賴大鼠伏隔核對戒斷癥狀及血漿β-內(nèi)啡肽的影響［J］.徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008 28(7):443－446.

［2］陳晗暉，郝偉，趙敏.物質(zhì)成癮中重要神經(jīng)核團(tuán)的作用［J］.中國藥物濫用防治雜志，2006 ，12(6):338－340.

［3］張新勇，潘貴書，徐國強(qiáng).毀損海洛因依賴大鼠伏隔核對戒斷癥狀及血漿β-內(nèi)啡肽的影響［J］.徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008 ，28(7):443－446.

［4］周燕，葉峻，韋獻(xiàn)良.海洛因成癮復(fù)吸大鼠中腦腹側(cè)被蓋區(qū)、伏隔核神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)和全腦多巴胺遞質(zhì)含量變化的研究［J］.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005 ，22(2):185－188.

［5］Koob GF.Drugs of abuse:anatomy，pharmacology and function of reward pathways［J］.TIPS，1992，13:177－184.

［6］諸葛啟釧，譯.大鼠腦立體定位圖譜［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005，第3 版，P176－182.

［7］孫玉科，張彥杰，李娜.人促凋亡蛋白基因bax 的克隆與原核表達(dá)［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，(13):2858－2861.

［8］趙毅，溫丙昭，李玲.Bcl-2、Bax 基因在急性白血病中的表達(dá)及意義［J］.新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，25(1):6－8.

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［10］劉徽婷，王嘉軍.海洛因依賴者神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫功能損傷［J］.中國藥物依賴性雜志，2009，(1):10－12.