孫麗華，崔海峰，孫明杰，馮淑怡，周艷華，彭?yè)P(yáng)中，于友華

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京100070)

隨著糖尿病(Diabetes mellitus，DM)發(fā)病率的日益增加，建立簡(jiǎn)易、穩(wěn)定、可靠、經(jīng)濟(jì)的糖尿病動(dòng)物模型越來越引起人們的關(guān)注。鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)是一種氨基葡萄糖-亞硝基脲類化合物，能夠選擇性地破壞哺乳動(dòng)物胰島β 細(xì)胞，從而誘發(fā)糖尿病，常用于糖尿病動(dòng)物模型的制備。然而STZ 的劑量選擇、動(dòng)物的飲食等因素制約著模型的穩(wěn)定性。此外，有報(bào)道，糖尿病模型大鼠存在空間學(xué)習(xí)記憶能力下降［1］，本文通過比較不同時(shí)間、劑量STZ 尾靜脈注射配合不同飲食條件建立糖尿病大鼠模型，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)模型動(dòng)物血糖變化，探討應(yīng)用STZ制備穩(wěn)定可靠DM 模型的方法，并通過Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，為糖尿病學(xué)習(xí)記憶能力改變提供基礎(chǔ)性的研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠70 只，體重(150 ±10)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2006-0009】。高脂飼料，由基礎(chǔ)鼠飼料加蔗糖、煉豬油和蛋黃按比例搭配制作(豬油18 %，蔗糖20%，蛋黃%，基礎(chǔ)飼料59%)，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2009-0008】。實(shí)驗(yàn)在中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障環(huán)境中進(jìn)行【SYXK(京)2010-0032】，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.2 藥品與主要儀器

鏈脲佐菌素購(gòu)自 Sigma 公司(批號(hào):040M1357)，檸檬酸(北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司，批號(hào):20091028)，檸檬酸二鈉(北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司，批號(hào):20070828)。TG(批號(hào):110501)、CHO(批號(hào):100731)，HDL-C(批號(hào):100401)，LDL-C(批號(hào):100351)測(cè)定試劑盒購(gòu)至北京中生北控生物科技股份有限公司。HEA-215 型血糖儀及配套試紙(歐姆龍，中國(guó))。Ethovision 小動(dòng)物行為軌跡跟蹤分析系統(tǒng)(Noldus 公司，荷蘭)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

動(dòng)物購(gòu)進(jìn)后適應(yīng)性喂養(yǎng)4 d，進(jìn)行隨機(jī)分組，根據(jù)飲食、STZ 注射時(shí)間、劑量的不同分為7 組，每組10 只動(dòng)物，共70 只，分別為:Ⅰ組:空白對(duì)照組;Ⅱ組:高糖高脂膳食組;Ⅲ組:0 周STZ(30 mg/kg)+高糖高脂膳食組;Ⅳ組:0 周STZ(30 mg/kg)+ 常規(guī)膳食組;Ⅴ組:6 周STZ(20 mg/kg)+ 高糖高脂膳食組;Ⅵ組:6 周STZ(25 mg/kg)+ 高糖高脂膳食組;Ⅶ組:6 周STZ(30 mg/kg)+ 高糖高脂膳食組。

1.2.2 主要試劑配制

檸檬酸緩沖液的配置:取檸檬酸(FW:210.14)2.1 g 加入超純水100 mL 中配成A 液，取檸檬酸二鈉(FW:294.10)2.94 g 加入超純水100 mL 中配成B 液，將A、B 液按1 ∶1 比例混合，用pH 計(jì)測(cè)定pH值，調(diào)到pH 值4.2～4.5 之間，即為所需的檸檬酸緩沖液。

STZ 的配置:注射前用檸檬酸緩沖液以1% 的濃度溶解STZ，溶解后30 min 內(nèi)注射完畢，現(xiàn)用現(xiàn)配，置于冰浴中。

1.2.3 模型制備

動(dòng)物購(gòu)進(jìn)后，常規(guī)飲食、水，適應(yīng)4 d，于注射STZ 前禁食12 h(20:00 至次日8:00)，根據(jù)分組情況，III 組、IV 組大鼠尾靜脈注射30 mg/kg STZ。高糖高脂膳食組尾靜脈注射同等劑量的檸檬酸緩沖液。注射后根據(jù)分組情況分別給予常規(guī)與高脂飲食。實(shí)驗(yàn)第6 周，V 組大鼠尾靜脈注射STZ(20 mg/kg);Ⅵ組注射STZ(25 mg/kg);VII 組注射STZ(30 mg/kg)。

1.2.4 血糖測(cè)定

于尾靜脈注射STZ 72 h 后，剪尾法取血，歐姆龍血糖儀測(cè)定大鼠隨機(jī)血糖值。以后每周監(jiān)測(cè)血糖1 次。

1.2.5 血脂檢測(cè)

總膽固醇采用CHO-PAP 法，甘油三酯采用GPO-PAP 法，高密度脂蛋白與低密度脂蛋白采用清除法。

1.2.6 血清胰島素、胰高血糖素檢測(cè)

放免法測(cè)定血清胰島素及胰高血糖素水平，由北京康源瑞得生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.7 Morris 水迷宮檢測(cè)各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力

(1)定位航行實(shí)驗(yàn)

［2］，歷時(shí)5 d，平臺(tái)固定在SE 象限，位于水面下1.5 cm，水溫穩(wěn)定在(25 ±0.5)℃。實(shí)驗(yàn)室中的物品和人員的位置在實(shí)驗(yàn)過程中固定不變，作為動(dòng)物的空間參照物。每天測(cè)試2 次，每次從不同象限中點(diǎn)將動(dòng)物面向池壁放入水中(入水點(diǎn)采用半隨機(jī)的方法，同一次測(cè)試中所有動(dòng)物的入水點(diǎn)相同)，檢測(cè)時(shí)間為120 s，在平臺(tái)上停留超過2 s 則判定為尋臺(tái)成功，動(dòng)物入水至尋臺(tái)成功時(shí)間為逃避潛伏期，若120 s 內(nèi)未找到平臺(tái)則潛伏期記為120 s。每次測(cè)試前先將動(dòng)物置于平臺(tái)上停留15 s，測(cè)試結(jié)束后適應(yīng)10 s。計(jì)算每天潛伏期平均值，以評(píng)價(jià)動(dòng)物空間記憶的獲得能力。

(2)空間搜索實(shí)驗(yàn)

定位航行結(jié)束次日，撤去平臺(tái)，選擇NW 象限作為入水象限，動(dòng)物在120 s 內(nèi)穿過原平臺(tái)位置的次數(shù)評(píng)價(jià)動(dòng)物的空間記憶能力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 4.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s 表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同條件造模對(duì)大鼠體重的影響

隨著時(shí)間延長(zhǎng)，各組大鼠體重均增加，Ⅲ組(0周STZ 30 mg/kg + 高糖高脂)大鼠體重明顯低于各實(shí)驗(yàn)組，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;高脂喂養(yǎng)6 周后，Ⅴ組、Ⅵ組、Ⅶ組大鼠體重高于對(duì)照組(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)第7 周時(shí)Ⅵ組、Ⅶ組體重較前降低，Ⅶ組降低明顯，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組體重均低于對(duì)照組(圖1，彩插3)。

2.2 不同造模條件對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠血糖的影響

STZ 尾靜脈注射72 h 后觀察大鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀，動(dòng)物萎靡不振，活動(dòng)少;造模后連續(xù)10 周動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血糖結(jié)果顯示，Ⅲ組大鼠尾靜脈注射STZ 72 h 后，與對(duì)照組相比，血糖升高明顯(P＜0.01)，于第2 周，升高最為顯著，以后逐漸下降，但仍維持較高水平(P＜0.01)，STZ 注射4 周血糖值相對(duì)穩(wěn)定，至觀察第10 周，血糖維持在15 mmol/L，與對(duì)照組比較，差異有顯著性。Ⅳ組大鼠造模后隨機(jī)血糖值較對(duì)照組升高，造模第2 周升高顯著，以后逐漸降低，于第9、10 周恢復(fù)正常水平。Ⅴ組、Ⅵ組、Ⅶ組第6 周造模后72 h 檢測(cè)，血糖升高明顯，以后逐漸降低，Ⅶ組降低緩慢，仍維持較高水平。Ⅱ組血糖與對(duì)照組比較，無明顯區(qū)別。以上結(jié)果提示，STZ的劑量，高脂飼料喂養(yǎng)是制備糖尿病模型的重要影響因素(圖2，彩插3)。

2.3 不同造模條件對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠血脂的影響

高糖高脂飼料喂養(yǎng)10 周后，各組大鼠CHO，TG，LDL-C 均增加，其中Ⅲ、Ⅶ組與對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.01);Ⅲ、Ⅶ組大鼠HDL-C 低于各實(shí)驗(yàn)組，但差異無顯著性。以上結(jié)果顯示，高糖高脂飼養(yǎng)與STZ 損傷對(duì)血脂異常具有相互促進(jìn)作用。

2.4 不同造模條件對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠血清胰島素、胰高血糖素的影響

放免法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組大鼠血清胰島素及胰高血糖素水平，結(jié)果顯示，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組大鼠血清INS 水平較對(duì)照組增高，但差異無顯著性。除Ⅳ組外，各組大鼠血清GLU 水平均較對(duì)照組增高，其中Ⅱ、Ⅶ組與對(duì)照組比較，差異有顯著性(P＜0.05)。

2.5 不同造模條件對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠學(xué)習(xí)、記憶功能的影響

定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，各組大鼠發(fā)現(xiàn)平臺(tái)的潛伏期逐漸縮短，與對(duì)照組相比，Ⅱ、Ⅲ組潛伏期較對(duì)照組減少，Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ組潛伏期明顯延長(zhǎng)，d4 結(jié)果顯示，Ⅶ組與對(duì)照組比較，差異有顯著性;空間搜索實(shí)驗(yàn)，各組之間差異無顯著性，提示造模后高脂喂養(yǎng)，與高脂喂養(yǎng)6 周后再造模，制備糖尿病模型不同，在一定范圍內(nèi)，血糖升高對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力具有促進(jìn)作用。結(jié)合前面血脂結(jié)果，高脂加高糖有降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)習(xí)、記憶能力的趨勢(shì)。

圖3 不同條件造模對(duì)大鼠血脂的影響Note:* P＜0.05 and ＊＊P＜0.01，compared with the controlFig.3 Effect of different modeling parameters on CHO，TG，HDL-c and LDL-c in the rats

圖4 不同條件造模對(duì)大鼠血中胰島素及胰高血糖素的影響Note:* P＜0.05 and ＊＊P＜0.01，compared with the controlFig.4 Effect of different modeling parameters on INS and GLU in the rats.

表2 水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果-潛伏期Tab.2 Results of place navigation by Morris water maze test(latency)in the rats

表3 水迷宮空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of spatial probe by Morris water maze test of the rats

3 討論

糖尿病是由遺傳與環(huán)境因素共同作用而導(dǎo)致的慢性全身性代謝性疾病。糖尿病動(dòng)物模型的制備是研究其發(fā)病、治療的基礎(chǔ)，同時(shí)也是研究的熱點(diǎn)、難點(diǎn)。目前制備糖尿病大鼠模型的方法主要有自發(fā)性動(dòng)物模型［3］、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型［4］和實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型［5］。但前兩者由于培育和飼養(yǎng)條件要求較嚴(yán)格，動(dòng)物價(jià)格昂貴，限制其在科學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用，而實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型因其制備周期短，飼養(yǎng)條件無特殊要求，成本低，已普遍用于糖尿病的基礎(chǔ)研究。

實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠模型的建立主要應(yīng)用鏈脲佐菌素、四氧嘧啶等化學(xué)物質(zhì)損傷胰島β 細(xì)胞。其中STZ 是一種氨基葡萄糖-亞硝基脲化合物，能夠特異性損傷胰島β 細(xì)胞，近年來，常用于糖尿病模型的制備，然而注射劑量，飲食情況對(duì)模型的存活率，成功率及穩(wěn)定性有很大的影響。本文比較不同時(shí)間、劑量STZ 尾靜脈注射配合不同飲食制備糖尿病模型，結(jié)果顯示，STZ 尾靜脈注射72 h 后觀察大鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀，動(dòng)物萎靡不振，活動(dòng)少，體重降低等糖尿病典型癥狀;高脂喂養(yǎng)與STZ(劑量大于25 mg/kg)注射能夠成功復(fù)制糖尿病模型，單純注射STZ 或高脂高糖飲食不能復(fù)制理想的糖尿病模型。已有報(bào)道糖尿病模型多采用腹腔注射方法制備，李楠等［6］研究采用一次性大劑量腹腔注射STZ與高脂高糖飼養(yǎng)配合小劑量STZ 兩種方法均建立了DM 模型，王春艷［7］研究采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)5 周，配合STZ(25 mg/kg)腹腔注射2 次，制備2 型糖尿病模型，盡管實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果大體相當(dāng)，然而血糖是動(dòng)態(tài)變化的過程，現(xiàn)有報(bào)道多數(shù)實(shí)驗(yàn)未對(duì)血糖做長(zhǎng)期觀察，而本實(shí)驗(yàn)通過STZ 注射后動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血糖的變化，為模型的穩(wěn)定性、進(jìn)一步應(yīng)用模型進(jìn)行藥理實(shí)驗(yàn)確定最佳給藥時(shí)間提供了參考。

此外，有研究顯示糖尿病大鼠可出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能的減退［8，9］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各高糖高脂飼養(yǎng)組潛伏期較對(duì)照組延長(zhǎng)、穿臺(tái)次數(shù)及平臺(tái)象限停留時(shí)間較對(duì)照組縮短，但差異無顯著性，可能與血糖高低及檢測(cè)時(shí)間相關(guān)，有待于進(jìn)一步驗(yàn)證與深入研究。

綜上，本研究通過動(dòng)態(tài)觀察不同劑量STZ 配合不同飲食制備糖尿病模型發(fā)現(xiàn)，STZ(30 mg/kg)配合高糖高脂膳食能夠快速、穩(wěn)定的建立糖尿病大鼠模型，高糖高脂膳食6 周后STZ(30 mg/kg)制備模型，血糖升高顯著，血清胰島素水平降低，傾向于1型糖尿病模型，通過對(duì)DM 模型制備方法的探討能夠?yàn)樘悄虿“l(fā)病機(jī)制研究及藥物開發(fā)提供可借鑒的模型。

(本文圖1，2 見彩插3。)

圖1 不同條件造模對(duì)各組大鼠體重的影響Note: *P＜ 0.05 and **P＜ 0.01, compared with the control group.Fig.1 Effect of different modeling parameters on the body weight of the rats

圖2 不同造模條件造模對(duì)大鼠血糖的影響Note: *P＜ 0.05 and **P＜ 0.01, compared with the control group.Fig.2 Effect of different modeling parameters on the blood glucose value of the rats

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