趙 統(tǒng) 呂坤聚 蔣捍東

（中國人民解放軍第401醫(yī)院呼吸內(nèi)科； 1青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，山東266000）

肺癌在上世紀(jì)50年代還被視為罕見的惡性腫瘤，現(xiàn)今估計(jì)每年210多萬人確診肺癌，110萬人死于肺癌［1］。盡管目前手術(shù)及放化療發(fā)展迅速，但肺癌患者的總體生存率仍低于15%，其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占到80%［2］，對(duì)于這一疾病急需深入的研究。近來研究表明，IKKβ／IκB／NF-κB 信號(hào)通路在NSCLC細(xì)胞中處于持續(xù)激活狀態(tài)，并通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄參與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展［3］。本研究應(yīng)用免疫組化的方法檢測(cè) NF－κB P65、p-IκBα、p-IKKβ在NSCLC組織及癌旁組織中的表達(dá)情況，探討三者與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系。

材料和方法

1.標(biāo) 本與資料

收集2009年10月-2010年10月解放軍第四零一醫(yī)院胸外科手術(shù)標(biāo)本56例NSCLC（排除以下患者1、手術(shù)之前進(jìn)行過放療或（和）化療者，2、合并有肺癌以外的其他腫瘤者，3、組織塊石蠟包埋不充分者。）其中鱗癌30例，腺癌26例。男性38例，女性18例；最大年齡75歲，最小年齡39歲，平均年齡55.1歲。隨機(jī)選擇20例NSCLC癌旁組織。將標(biāo)本用10%中性甲醛溶液固定，脫水、透明、石蠟包埋。組織病理分類及分級(jí)由我院病理科醫(yī)生確定，結(jié)合手術(shù)、影像學(xué)檢查（每位病人均有胸部CT、顱腦MRI（或CT）、骨素描、腹部B超或全身PET-CT檢查）進(jìn)行TNM分期。

2.方 法和試劑

石蠟包埋的組織塊經(jīng)5μm厚連續(xù)切片，分別做HE染色和免疫組織化學(xué)染色。免疫組化染色采用Elivision法。步驟如下：脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖液高壓修復(fù)抗原、自然冷卻至室溫、3%過氧化氫溶液封閉、加一抗（稀釋比例1：200）后4℃過夜、37℃復(fù)溫、加二抗37℃反應(yīng)、DAB顯色、蘇木素復(fù)色、鹽酸酒精分化、脫水透明、中型樹膠封片。用PBS液取代一抗做空白對(duì)照。兔抗人p-IKKβ（磷酸化IKKβ）單克隆抗體、兔抗人p-IκBα（磷酸化IκBα）單克隆抗體、兔抗人NF－κB P65單克隆抗體均購自博世德生物技術(shù)有限公司。顯色試劑盒購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

3.結(jié) 果判斷

NF-κB P65的表達(dá)主要位于胞核及胞漿中有黃色顆粒，p-IκBα、p-IKKβ的表達(dá)主要位于胞漿中有黃色顆粒，少數(shù)胞核內(nèi)亦可有表達(dá)。染色強(qiáng)度計(jì)分：通過顯微鏡觀察，0分為陰性；1分為弱陽性，染色為淡黃色；2分為陽性，染色為黃色；3分為強(qiáng)陽性，染色為棕褐色。著色細(xì)胞百分率計(jì)分：評(píng)定每張切片10個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)著色細(xì)胞百分比：陽性細(xì)胞≤5%為0分，6%－25%為1分，26%－50%為2分，51%－75%為3分，＞76%為4分。以陽性細(xì)胞百分率記分和強(qiáng)度記分相乘所得總分進(jìn)行判斷，總分0分為陰性，1-4分為（＋），5-8分為（＋＋），9-12分為（＋＋＋）。

4.統(tǒng) 計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組內(nèi)分級(jí)比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.N F-κB P65、p-IκBα、p-IKKβ在 NSCLC組織中及癌旁組織中的表達(dá)

NF-κB P65蛋白的陽性表達(dá)主要定位在胞核及胞漿（圖1），p-IκBα、p-IKKβ蛋白的陽性主要定于胞漿（圖2、3），三者在NSCLC中陽性率分別為83.9%（47／56）、55.7%（31／56）69.6%（39／56），癌旁組織陽性率分別為20% （4／20）、25% （5／20）、30%（6／20）。NF-κB P65、p-IκBα、p-IKKβ在 NSCLC中的陽性率均高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

2.N F-κB P65、p-IκBα、p-IKKβ表達(dá)與 NSCLC臨床病理間的關(guān)系

在 NSCLC組織中 NF-κB P65、p-IκBα、p-IKKβ蛋白的表達(dá)與患者的年齡、性別、組織類型無相關(guān)性（P＞0.05），但與 NSCLC的吸煙史、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P＜0.05）（表2）。

表1 NF－κB P65、IκBα、IKKβ在 NSCLC和癌旁組織的表達(dá)Table 1 Association of NF-κB P65、IκBα、IKKβstaining status in case，adjucent tissues

表2 NF－κB P65、IκBα、IKKβ表達(dá)與 NSCLC臨床病理特征的關(guān)系Table 2 The relationship between NF-κB P65、IκBα、IKKβexpressions in NSCLC and pathological characteristics factors

圖1 NF－κB P65在肺癌中呈陽性，×400倍。 Fig.1NF-κB P65strong expression in case，×400圖2 p-IκBα在肺癌中呈陽性，×400倍。 Fig.2p-IκBαPositive expression in case，×400圖3 p-IKKβ在肺癌中呈陽性，×400倍。 Fig.3p-IKKβstrong expression in case，×400

3.NF-κB P65、p-IκBα、p-IKKβ之間相關(guān)性

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn) NF-κB P65和p-IκBα共表達(dá)22例，共陰性10例，p-IκBα和 p-IKKβ共表達(dá)19例，共陰性15例，兩組數(shù)據(jù)經(jīng) McNemarχ2分析，P＜0.05，故 NF－κB P65和p-IκBα，p-IκBα和p-IKKβ存在正相關(guān)。

討 論

1986年，Sen和Baltimore首次從B細(xì)胞提取物中檢測(cè)到一種可與免疫球蛋白κ輕鏈基因增強(qiáng)子κB序列特異性結(jié)合的核蛋白因子，稱之為核因子κB［4］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，IKK／IκB／NF-κB信號(hào)通路與多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)，例如胰腺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌［5－8］。Tang等用免疫組化的方法觀察肺癌組織中NF-κB P65表達(dá)，發(fā)現(xiàn)肺癌組織中NF-κB P65表達(dá)明顯高于正常肺組織［9］。Jin等采用凝膠蛋白電泳及免疫組化法發(fā)現(xiàn)肺癌組織中NF－κB P65核內(nèi)表達(dá)及p-IκBα、p-IKKβ胞漿內(nèi)表達(dá)高于癌旁組織［10］。本研究結(jié)果顯示在NSCLC組織中NF-κB P65核內(nèi)表達(dá)及p-IκBα、p-IKKβ胞漿內(nèi)表達(dá)明顯高于癌旁組織，兩者存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與上述研究結(jié)果相似。在本次試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在吸煙組、TNM分期為Ⅲ、Ⅳ期組以及轉(zhuǎn)移組中NF－κB P65核內(nèi)表達(dá)及p-IκBα、p-IKKβ胞漿內(nèi)表達(dá)明顯高于非吸煙組、TNM分期為Ⅰ、Ⅱ期組以及無轉(zhuǎn)移組。Zhang等報(bào)道稱肺癌組織中NF－κB高表達(dá)提示組織分化更差，更高惡性程度［11］。也曾有報(bào)道發(fā)現(xiàn)NF-κB P65、p-IκB在 NSCLC高表達(dá)，提示 NSCLC患者生存率降低［12］。上述研究與作者結(jié)果相似。作者發(fā)現(xiàn) NF－κB P65和 p-IκBα，p-IκBα和 p-IKKβ存在正相關(guān)。與此前研究一致：NF-κB通常在胞漿中與IκB結(jié)合為無活性的化合物。當(dāng)Ikk被激活，進(jìn)一步將IκB磷酸化，而使 NF-κB／IκB發(fā)生解離，NF-κB進(jìn)入胞核內(nèi)，與相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［13－14］。以上研究表明：IKK／IκB／NF-κB 信號(hào)通路在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移起著重要作用。

IKK／IκB／NF-κB信號(hào)通路在 NSCLC 發(fā)生發(fā)展中的重要作用不言而喻，然而其在NSCLC中活化及作用機(jī)制尚不明確，有研究顯示：由于受NF－κB轉(zhuǎn)錄激活的基因多達(dá)上百種，其中包括炎性因子、黏附分子、化學(xué)趨化因子、基質(zhì)金屬蛋白酶，以及多種增殖和凋亡相關(guān)基因。NF-κB活性增強(qiáng)，進(jìn)而使上述基因表達(dá)增加，后者促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移［15］。因此采用抑制 NF－κB蛋白活化，阻止其下游基因激活的方法，NF-κB可能成為腫瘤治療中新的靶基因。

總之，IKK／IκB／NF-κB信號(hào)通路在 NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，充分了解該通路可為NSCLC的診斷治療提供新的方法。

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