吳 鋒 熊克仁 王麗發(fā)

（皖南醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，安徽 蕪湖241002）

氯胺酮（Ketamine）為非競爭性 N－甲基-D-天門冬氨酸（N-methyl-aspartate，NMDA）受體拮抗劑，作為一種分離性麻醉藥應(yīng)用于臨床，其作用機(jī)制復(fù)雜，由于其具有一定的致幻作用而被濫用于各種娛樂場所，又稱為“K”粉，是目前藥物濫用中的一個(gè)新問題［1］。氯胺酮濫用可激活腦內(nèi)獎(jiǎng)賞通路即中腦邊緣 多 巴 胺 系 統(tǒng) （Mesolimbic dopamine system，MLDS），目前認(rèn)為所有藥物成癮性可能是直接或間接作用于MLDS。MLDS主要結(jié)構(gòu)包括中腦腹側(cè)背蓋區(qū)（ventral tegmental area，VTA）、伏隔核（Nucleus accumbens，NAc）和前額葉皮質(zhì)（Prefrontal cortex，PFC），當(dāng)該通路被激活時(shí)，VTA含多巴胺（Dopamine，DA）遞質(zhì)的DA神經(jīng)元放電活動(dòng)增強(qiáng)，通過神經(jīng)纖維與NAc和PFC相聯(lián)系，導(dǎo)致NAc及PFC的DA釋放增加，導(dǎo)致藥物成癮［2］。但對NAc主要纖維傳出核團(tuán)之一的腹側(cè)蒼白球（Ventral Pallidum，VP）研究甚少，有研究表明毀損VP可明顯減少嗎啡依賴大鼠的覓藥行為，VP是調(diào)節(jié)成癮藥物強(qiáng)化作用的重要部位，NAc-VP通路是藥物刺激和強(qiáng)化的共同通路［3］。還有研究表明c-fos表達(dá)明顯增強(qiáng)與大鼠嗎啡依賴有關(guān)［4］，c-fos也參與了氯胺酮所致精神癥狀的分子機(jī)制［5］，而低頻電針可使NAc、VP神經(jīng)元c-fos表達(dá)明顯減少，能治療海洛因覓藥行為［6］。但針灸施治的時(shí)辰與療效關(guān)系密切，不同時(shí)辰針灸對肺癌病鼠腦干內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)影響是不同的，子時(shí)針灸組T淋巴細(xì)胞活性率最高，午時(shí)最低，卯時(shí)針灸組巨噬細(xì)胞吞噬率最強(qiáng)［7］，那么不同時(shí)辰電針對氯胺酮濫用成癮大鼠VP酪氨酸羥化酶（Tyrosine hydroxylase ，TH，DA 合成 的關(guān)鍵酶）、c-fos表達(dá)的影響如何，值得研究。

材料和方法

1.材 料及試劑

雄性SD大鼠56只，體重220±20g，清潔級，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號：SCXK（浙）2008-0033，保持室溫23±2℃，相對濕度60%－65%，自然光照，自由進(jìn)水，給藥前禁食12h。顆粒飼料由皖南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。將大鼠隨機(jī)分為正常 對 照 組、生 理 鹽 水 （10ml／kg）組、氯 胺 酮（100mg／kg）組、氯胺酮加四個(gè)時(shí)辰電針組，每組8只。鹽酸氯胺酮注射液（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號 KH090704，規(guī)格2ml：100mg）；兔抗c-fos、鼠抗TH及SABC免疫組化試劑盒（博士德公司）。

2.方 法

2.1 造模方法

采用氯胺酮100mg／kg進(jìn)行大鼠腹腔注射，每天一次，連續(xù)一周，第一次給藥后大鼠表現(xiàn)出呼吸加快、呼吸道分泌物增多，隨后出現(xiàn)活動(dòng)增多、尾巴僵直上翹的興奮癥狀，隨著用藥次數(shù)的增多，興奮癥狀明顯增多，表現(xiàn)為扭體、站立、跳躍、清理皮毛、轉(zhuǎn)圈、四腳朝天等。出現(xiàn)上述癥狀大鼠作為造模成功大鼠，用于實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 電針方法

電針組于給藥一周后開始，分別在子時(shí)、卯時(shí)、午時(shí)、酉時(shí)給予低頻（2Hz）電針交替刺激“足三里”與“三陰交”穴（其中第一天同時(shí)刺激左側(cè)“足三里”與“三陰交”穴，第二天同時(shí)刺激右側(cè)“足三里”與“三陰交”穴，如此交替），持續(xù)30min，強(qiáng)度3V，波寬1ms，每天一次，連續(xù)一周。

2.3 指標(biāo)檢測方法

各組大鼠處理完畢后2h，用30mg／kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，暴露心臟，經(jīng)左心室－升主動(dòng)脈插管灌注固定。先快速灌注溫生理鹽水100ml，再灌注4℃的1%多聚甲醛磷酸緩沖液300ml，30min內(nèi)灌注完畢。取腦，后固定于4%甲醛固定液中，6h后，入梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋。連續(xù)切片，片厚5μm，切片分組收集。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶5-10min，95℃-98℃電爐熱修復(fù)，斷電兩次，5%正常羊血清封閉，置37℃溫箱1h之后滴加抗TH、c-fos抗體，置濕盒內(nèi)4℃過夜。第二天37℃溫箱復(fù)溫1h，滴加相應(yīng)的生物素化的二抗，置37℃溫箱2h，滴加辣根過氧化酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，置37℃溫箱1h，DABH2O2顯色10-30min。各步驟間均用0.02mol／L PBS（pH7.2-7.4）洗5min×3次，對照實(shí)驗(yàn)用PBS代替一抗，其余步驟相同，顯色之后常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片，光鏡下觀察。

2.4 神經(jīng)元計(jì)數(shù)及圖像處理

每組選取相同冠狀切面的切片各16張（其中每只選取2張），參照王平宇的大鼠腦讀片圖譜，在10×10倍光鏡下利用讀數(shù)顯微鏡對每張切片VP區(qū)相同區(qū)域（選定1mm2的區(qū)域）的TH、c-fos陽性神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)，并用黑馬病理圖像分析系統(tǒng)測量平均灰度值。

3.統(tǒng) 計(jì)學(xué)處理

神經(jīng)元數(shù)量和平均灰度值結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，顯著性檢驗(yàn)采用方差分析、q檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.一 般狀況

氯胺酮100mg／kg第一次給藥（腹腔注射，1次／d）后大鼠表現(xiàn)出呼吸加快、呼吸道分泌物增多，隨后出現(xiàn)活動(dòng)增多、尾巴僵直上翹的興奮癥狀，隨著用藥次數(shù)的增多，興奮癥狀明顯增多，表現(xiàn)為扭體、站立、跳躍、清理皮毛、轉(zhuǎn)圈、四腳朝天等。氯胺酮連續(xù)給藥一周后停藥，分別在子時(shí)、卯時(shí)、午時(shí)、酉時(shí)給予低頻（2Hz）電針交替刺激“足三里”與“三陰交”穴，連續(xù)一周。午時(shí)、酉時(shí)電針組大鼠癥狀得到有效改善，活動(dòng)接近正常大鼠；子時(shí)、卯時(shí)電針組大鼠癥狀改善不明顯。

2.免 疫組織化學(xué)結(jié)果

2.1 各組大鼠VP TH陽性神經(jīng)元數(shù)量與平均灰度值（表1，圖 A1-7）

TH陽性神經(jīng)元呈現(xiàn)棕色或棕褐色，主要為胞膜與胞漿染色，胞核不著色。與正常對照組相比，生理鹽水組VP TH陽性神經(jīng)元數(shù)量與細(xì)胞平均灰度值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；氯胺酮組VP TH陽性神經(jīng)元數(shù)量增加 （P＜0.01），細(xì)胞平均灰度值降低（P＜0.01），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與氯胺酮組相比，子時(shí)電針組和卯時(shí)電針組VP TH陽性神經(jīng)元數(shù)量與細(xì)胞平均灰度值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；午時(shí)電針組和酉時(shí)電針組VP TH陽性神經(jīng)元數(shù)量減少（P＜0.01），細(xì)胞平均灰度值升高（P＜0.01），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組大鼠VP TH陽性神經(jīng)元數(shù)量及細(xì)胞平均灰度值（ˉx±s，n＝16）Table 1 The number of TH IR positive neurons and average gray value in VP in each group（ˉx±s，n＝16）

2.2 各組大鼠VP c-fos陽性神經(jīng)元數(shù)量與平均灰度值（表2，圖B 1-7）

c-fos陽性神經(jīng)元呈現(xiàn)棕色或棕黃色，主要為胞膜與胞漿染色，胞核不著色。與正常對照組相比，生理鹽水組VP c-fos陽性神經(jīng)元數(shù)量與細(xì)胞平均灰度值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；氯胺酮組VP c-fos陽性神經(jīng)元數(shù)量增加（P＜0.01），細(xì)胞平均灰度值降低（P＜0.01），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與氯胺酮組相比，子時(shí)電針組和卯時(shí)電針組VP c-fos陽性神經(jīng)元數(shù)量與細(xì)胞平均灰度值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；午時(shí)電針組和酉時(shí)電針組 VP c-fos陽性神經(jīng)元數(shù)量減少（P＜0.01），細(xì)胞平均灰度值升高（P＜0.01），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各組大鼠VP c-fos陽性神經(jīng)元數(shù)量及平均灰度值（ˉx±s，n＝16）Table 2 The number of c-fos IR positive neurons and average gray value in VP in each group（ˉx±s，n＝16）

討 論

VP是基底神經(jīng)核和丘腦皮質(zhì)環(huán)路的重要組成部分，其內(nèi)神經(jīng)元含有多種神經(jīng)遞質(zhì)如DA、谷氨酸、γ－氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、神經(jīng)肽等。與對運(yùn)動(dòng)的興奮或抑制性調(diào)節(jié)、獎(jiǎng)賞行為、記憶的強(qiáng)化有關(guān)［8］。VP作為NAc的重要投射部位之一，是調(diào)節(jié)大鼠嗎啡強(qiáng)化效應(yīng)的重要部位［3］。本實(shí)驗(yàn)TH結(jié)果表明氯胺酮濫用，大鼠VP TH陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯增多，細(xì)胞平均灰度值明顯降低，說明免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞染色越深，間接表明VP TH含量增高，DA合成增多，引起大鼠的行為學(xué)改變，提示VP也是大鼠氯胺酮成癮強(qiáng)化效應(yīng)的重要腦區(qū)之一。氯胺酮為非競爭性NMDA受體拮抗劑，氯胺酮濫用可激活腦內(nèi)的獎(jiǎng)賞通路即MLDS，生理狀態(tài)下，VTA DA能神經(jīng)元活動(dòng)受到GABA能抑制性中間神經(jīng)元的緊張性抑制，并且此抑制性中間神經(jīng)元上存在NMDA受體，在與NMDA受體拮抗劑氯胺酮結(jié)合后，GABA能神經(jīng)元活動(dòng)被抑制，GABA的釋放減少，取消了對于DA能神經(jīng)元的緊張性抑制，使VTA DA 能神經(jīng)元放電活動(dòng)增加［9］。VTA通過神經(jīng)纖維與NAc相聯(lián)系，導(dǎo)致NAc DA釋放增加，繼而經(jīng)NAc-VP通路使VP DA釋放增加。許霽虹等［5］研究表明氯胺酮100mg／kg腹腔注射，注射后1h可引起大腦皮質(zhì)c-fos表達(dá)增高，本實(shí)驗(yàn)c-fos結(jié)果表明氯胺酮100mg／kg腹腔注射連續(xù)1周后引起VP c-fos表達(dá)明顯增高。c-fos在許多刺激誘導(dǎo)下可快速短暫地表達(dá)，隨后調(diào)節(jié)反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，可能導(dǎo)致谷氨酸大量異常釋放，在外界刺激－轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的信息傳遞過程中起著第三信使的作用，是許多刺激引起神經(jīng)元活動(dòng)的結(jié)果。臨床應(yīng)用氯胺酮麻醉可使腦血流量增加，腦代謝率、耗氧量也增加，氯胺酮引起的精神癥狀與腦代謝增加和細(xì)胞活動(dòng)異常有關(guān)。氯胺酮誘導(dǎo)c-fos在大腦皮質(zhì)和VP等腦區(qū)異常表達(dá)，提示該區(qū)域的神經(jīng)元可能發(fā)生損傷，提示c-fos可能參與了氯胺酮麻醉后及濫用所致精神癥狀的分子機(jī)制。

氯胺酮誘導(dǎo)c-fos在VP異常表達(dá)，VP神經(jīng)元可能發(fā)生損傷，此損傷是否為可逆性的呢？有研究表明嗎啡等慢性用藥可誘導(dǎo)NAc c-fos表達(dá)增加的主要原因可能是由于內(nèi)源性DA釋放所致，引起Fos蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，致神經(jīng)毒性，導(dǎo)致神經(jīng)元受損傷，但這種損傷可能是可逆轉(zhuǎn)的［4］。藥物成癮是一種慢性腦病，而針灸則具有神經(jīng)調(diào)節(jié)作用。針灸療法具有簡便、安全、價(jià)廉等特點(diǎn)，被廣泛用于臨床。在戒毒方面，針灸也取得一定的療效。電針刺激“神門”穴明顯降低嗎啡成癮大鼠NAc DA的釋放［10］。孫麗敏等［6］研究報(bào)道低頻電針刺激“三陰交”穴可使VP等腦區(qū)內(nèi)神經(jīng)元c-fos表達(dá)明顯減少，能治療海洛因覓藥行為。本實(shí)驗(yàn)通過不同時(shí)辰電針交替針刺“足三里”和“三陰交”穴治療氯胺酮濫用成癮大鼠一周后，午時(shí)和酉時(shí)電針可明顯降低VP TH和c-fos陽性神經(jīng)元的數(shù)量，增高細(xì)胞平均灰度值，說明TH、c-fos免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞染色越深，提示午時(shí)和酉時(shí)電針可減少VP DA的合成，VP c-fos表達(dá)也明顯降低。電針能明顯改善氯胺酮濫用大鼠的成癮癥狀并使其活動(dòng)接近正常大鼠。提示電針的這種作用機(jī)制可能為電針可促使VP等腦區(qū)神經(jīng)元GABA的釋放，恢復(fù)GABA對DA的抑制，減少DA的合成、釋放，繼而減弱c-fos的表達(dá)，調(diào)節(jié)VP等成癮相關(guān)腦區(qū)的神經(jīng)適應(yīng)，修復(fù)可逆性的神經(jīng)元損傷，改善癥狀。但本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)子時(shí)和卯時(shí)電針對氯胺酮濫用大鼠VP TH、c-fos表達(dá)的改變不明顯，表明電針對TH、c-fos表達(dá)的影響有時(shí)辰差異。我室曾研究表明2Hz低頻電針針刺大鼠“足三里”穴對大鼠杏仁核一氧化氮合酶表達(dá)的影響有時(shí)辰差異［11］，陳曉莉等［12］研究表明不同時(shí)辰針刺家兔“合谷”穴，對降低血漿5-羥色胺的含量也存在時(shí)辰差異。這種時(shí)辰差異性可能與機(jī)體的晝夜節(jié)律性變化有關(guān)，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

電針對氯胺酮等藥物濫用成癮的戒毒治療有效，但其機(jī)制復(fù)雜，涉及神經(jīng)生化機(jī)制、神經(jīng)生理機(jī)制及其他機(jī)制等，目前確切機(jī)制仍不完全清楚，還需進(jìn)行大量深入的研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在應(yīng)用電針戒毒治療時(shí)，應(yīng)考慮時(shí)間因素對療效的影響，以提高治療效果。

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［12］陳曉莉，宋開源.不同時(shí)辰電針軟組織損傷家兔合谷穴的鎮(zhèn)痛作用及對血漿5-羥色胺的影響.成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，24（3）：25-26

圖 版 說 明

（箭頭所指為陽性神經(jīng)元）

圖A1 正常對照組VP TH陽性神經(jīng)元 ×100

圖A2 生理鹽水組VP TH陽性神經(jīng)元 ×100

圖A3 氯胺酮組VP TH陽性神經(jīng)元 ×100

圖A4 子時(shí)電針組VP TH陽性神經(jīng)元 ×100

圖A5 卯時(shí)電針組VP TH陽性神經(jīng)元 ×100

圖A6 午時(shí)電針組VP TH陽性神經(jīng)元 ×100

圖A7 酉時(shí)電針組VP TH陽性神經(jīng)元 ×100

圖B1 正常對照組VP c-fos陽性神經(jīng)元 ×100

圖B2 生理鹽水組VP c-fos陽性神經(jīng)元 ×100

圖B3 氯胺酮組VP c-fos陽性神經(jīng)元 ×100

圖B4 子時(shí)電針組VP c-fos陽性神經(jīng)元 ×100

圖B5 卯時(shí)電針組VP c-fos陽性神經(jīng)元 ×100

圖B6 午時(shí)電針組VP c-fos陽性神經(jīng)元 ×100

圖B7 酉時(shí)電針組VP c-fos陽性神經(jīng)元 ×100

EXPLANATION OF FIGURES

（Chart arrow referring to positive neurons）

Fig.A1TH IR positive neurons in the VP of normal control group×100

Fig.A2TH IR positive neurons in the VP of normal saline group×100

Fig.A3TH IR positive neurons in the VP of ketamine group×100

Fig.A4TH IR positive neurons in the VP of Zi Shi EA group×100

Fig.A5TH IR positive neurons in the VP of Mao Shi EA group×100

Fig.A6TH IR positive neurons in the VP of Wu Shi EA group×100

Fig.A7TH IR positive neurons in the VP of You Shi EA group×100

Fig.B1c-fos positive neurons in the VP of normal control group×100

Fig.B2c-fos positive neurons in the VP of normal saline group×100

Fig.B3c-fos positive neurons in the VP of ketamine group×100

Fig.B4c-fos positive neurons in the VP of Zi Shi EA group×100

Fig.B5c-fos positive neurons in the VP of Mao Shi EA group×100

Fig.B6c-fos positive neurons in the VP of Wu Shi EA group×100

Fig.B7c-fos positive neurons in the VP of You Shi EA group×100