陸娜娜 尹 玉 李 昊 江 燕 曹立宇

（安徽醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，合肥230032）

大腸癌（colorectal carcinoma，CRC）是人類消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，在我國，由于飲食習(xí)慣和生活方式的改變，其發(fā)病率呈逐漸上升趨勢。大腸癌的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移過程受到多種因素的影響，其中血管生成對腫瘤的生長起重要作用，是影響腫瘤生物行為的重要因素。腫瘤血管的形成受多種因子調(diào)節(jié)，其中最重要的是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endotelial growth factor，VEGF），近來有報(bào)道VEGF直接由信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄活化子3（signal transducers and activators of transcription，STAT3）蛋白調(diào)節(jié)，并已在肺癌、胃癌、乳腺癌等腫瘤 中 得 到 證 實(shí)［1－3］。 本 研 究 采 用 免 疫 組 化 S-P（streptavidin-eroxidase，鏈霉菌抗生物素－過氧化物酶）法檢測大腸癌組織中STAT3和VEGF的表達(dá)，分析其在大腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，以及兩者間的關(guān)系。

材料和方法

1.標(biāo) 本來源

收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2007年月-2008年月間住院大腸癌手術(shù)切除標(biāo)本62例，所有病例術(shù)前均未接受放療、化療及其他針對腫瘤的特殊治療，且術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)。其中，男41例，女21例；年齡37-89歲，中位年齡57歲。高分化腺癌16例，中分化腺癌30例，低分化腺癌16例；浸潤突破肌層者45例，未突破肌層者17例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者28例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者34例；Duke＇s分期：A期與B期共34例，C期與D期共28例。另取20例距癌灶邊緣5cm以上切緣的正常大腸粘膜組織作為對照。所有標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，分別作HE染色和免疫組化染色。

2.主 要試劑

鼠抗人STAT3單克隆抗體（SC-8019）購自Santa Cruz公司，鼠抗人VEGF單克隆抗體（MAB-0243）及廣譜免疫組化S-P試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。DAB（3，3＇-diaminobenzidine，3，3＇－二氨基聯(lián)苯胺）顯色試劑盒購自北京中杉生物有限公司。

3.實(shí) 驗(yàn)方法

免疫組織化學(xué)染色（S-P法）參照試劑盒說明書操作，用已知陽性切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

4.結(jié) 果判斷

STAT3和VEGF免疫組化染色表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色顆粒。采用半定量方法，（1）按細(xì)胞染色強(qiáng)弱評分：0分不著色，1分淺黃色，2分棕黃色，3分棕褐色。（2）選取5個(gè)高倍視野（×400），計(jì)數(shù)陽性染色細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比：1分＜25%，2 分 26%-50%，3 分 50%-75%，4 分 ＞75%。按（1）、（2）乘積判斷結(jié)果：≤1為陰性（－），＞1為陽性（＋）。

5.統(tǒng) 計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各樣本資料差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用χ2檢驗(yàn)方法，Spearman相關(guān)分析檢驗(yàn)方法，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.大 腸癌中STAT3和VEGF蛋白表達(dá)與臨床病理因素間的關(guān)系

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組STAT 3和VEGF陽性表達(dá)率分別為78.6%（22／28）、89.3%（25／28），均高于陰性組52.9%（18／34）、64.7%（22／34），兩者比較差異有顯著性（P＜0.05）。Duke＇s臨床分期中，C＋D期STAT3和VEGF陽性表達(dá)率分別為78.6%（22／28）、89.3%（25／28），均高于 A＋B 期52.9%（18／34）、64.7%（22／34），兩者比較差異有顯著性（P＜0.05）。STAT3和VEGF表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤分化程度及浸潤深度均無關(guān)（P＞0.05，表1）。

表1 STAT3和VEGF與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系Table 1 The relationship of STAT3and VEGF expression and clinicopathological manifestations in colorectal carcinoma

2.S TAT3和VEGF蛋白在大腸癌組織和正常大腸黏膜組織中的表達(dá)

STAT3和VEGF蛋白在65例大腸癌組織中的陽性表達(dá)率分別為64.5%（40／62）、75.8%（47／62），在20例正常大腸癌黏膜中的陽性表達(dá)率分別為35%（7／20）、30%（6／20）。STAT3和 VEGF蛋白在大腸癌組織中的表達(dá)均顯著高于正常大腸黏膜（P＜0.05，表2，圖1，圖2）。

表2 STAT3和VEGF在正常大腸黏膜和大腸癌組織中的表達(dá)Table 2 Expressions of STAT3and VEGF in normal colorectal mucosa and colorectal carcinoma

圖1 大腸癌組織中STAT3蛋白呈陽性表達(dá)（S-P×200）圖2 大腸癌組織中VEGF蛋白呈陽性表達(dá)（S-P×200）Fig 1The expression of STAT3protein is positive in colorectal carcinoma.（S-P method×200）Fig 2The expression of VEGF protein is positive in colorectal carcinoma.（S-P method×200）

3.S TAT3和VEGF蛋白在大腸癌組織中表達(dá)之間的關(guān)系

在62例大腸癌中，STAT3和VEGF蛋白表達(dá)均陽性36例，均陰性11例，前者陽性而后者陰性4例，前者陰性而后者陽性11例。Livin和Survivin蛋白在大腸癌中的表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.447，P＜0.01，表3）。

表3 大腸癌組織中STAT3和VEGF蛋白表達(dá)之間的關(guān)系Table 3 Association between STAT3and VEGF expression in colorectal carcinoma

討 論

腫瘤新生血管的生成是腫瘤組織生長的必備條件，同時(shí)也是腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。VEGF又稱血管滲透因子，于1989年在牛垂體濾泡星狀細(xì)胞體外培養(yǎng)液中首先純化出來［4，5］。VEGF基因定位于第六號染色體長臂（6p21.3）上，由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成，其編碼產(chǎn)物是相對分子質(zhì)量約為46 000kDa的糖蛋白二聚體，對血管有高度特異性，對肝素有一定親和力。由于VEGF mRNA選擇性拼接方式不同，VEGF家族成員包括 VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D 和胎盤生長因子，其中研究最多的是VEGF-A。VEGF是目前所知最強(qiáng)的直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子［6］，有很強(qiáng)的促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增生、遷移和增強(qiáng)血管通透性的作用。也是一種有效的血管形成和血管通透性誘導(dǎo)因子，由內(nèi)皮細(xì)胞、粒細(xì)胞、巨核細(xì)胞等合成釋放［7］。研究表明，VEGF的表達(dá)具有一定的異質(zhì)性，廣泛地表達(dá)于多種細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞；其中以腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞為主。

非受體和受體酪氨酸激酶，如Src（屬于非受體酪氨酸激酶Src家族成員）、EGFR等是VEGF的主要誘導(dǎo)子，這些酪氨酸激酶信號通過多種途徑傳遞，STAT3是這些途徑的一個(gè)交匯點(diǎn)。STAT是一族具有高度同源性的轉(zhuǎn)錄因子，是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子雙重功效的DNA結(jié)合蛋白，可以在外界信號的刺激下激活并直接轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)引發(fā)相應(yīng)靶基因的轉(zhuǎn)錄。STAT約有750-900個(gè)氨基 酸， 分 子 量 84000-113000， 由 STAT1-4、STAT5a、STAT5b、STAT6 等 7 個(gè) 成 員 組 成［8］。STATs在結(jié)構(gòu)上包括6個(gè)功能區(qū)，分別為N端的氨基酸保守序列、卷曲螺旋區(qū)、DNA結(jié)合域、連接區(qū)、SH2結(jié)構(gòu)域、C端的轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域。STAT3在正常組織中的表達(dá)是快速而短暫的，而在多種惡性腫瘤組織，如頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌中，STAT3表現(xiàn)為持續(xù)性激活和高表達(dá)，并且與腫瘤的惡性程度及預(yù)后密切相關(guān)［9－12］。有研究發(fā)現(xiàn)STAT3可結(jié)合于VEGF基因的啟動(dòng)子區(qū)域，從而調(diào)控VEGF的表達(dá)［13］。并且，STAT3還可抑制缺氧誘導(dǎo)因子（HIF1a）的降解，增加HIF1a的合成，從而間接上調(diào)VEGF的表達(dá)［14］。因此，STAT3信號通路的阻斷，可引起多種信號途徑介導(dǎo)的腫瘤血管生成的阻斷，從而阻止腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

研究結(jié)果顯示，STAT3和VEGF蛋白在大腸癌組織中陽性表達(dá)率顯著高于正常黏膜，并且分別與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及臨床Duke，s分期有關(guān)，與患者年齡、性別及腫瘤分化程度、浸潤深度無關(guān)。STAT3和VEGF蛋白在大腸癌組織的陽性表達(dá)呈正相關(guān)。提示STAT3和VEGF在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中均具有重要作用，同時(shí)兩者具有協(xié)同作用，聯(lián)合檢測較單一檢測更有意義。

［1］Weerasinghe P，Garcia GE，Zhu Q，et al.Inhibition of Stat3activation and tumor growth suppression of nonsmall cell lung cancer by G-quartet oligonucleotides.Int J Oncol，2007，31（1）：129-136

［2］Zhu BH，Zhan WH，Li ZR，et al.（-）-Epigallocatechin-3-gallate inhibits growth of gastric cancer by reducing VEGF production and angiogenesis.World J Gastroenterol，2007，13（8）：1162-1169

［3］Hsieh FC，Cheng G，Lin J.Evaluation of potential Stat3-regulated genes in human breast cancer.Biochem Biophys Res Commun，2005，335（2）：292-299

［4］Kumar H，Heer K，Lee PW，et al.Preoperative serum vasular endothelial growth factors can predict stage in colorectal cancer.Clin Cancer Res，1998，4（5）：1279-1285

［5］Ferrara N，Gerber HP，Le Couter J.The biology of VEGF and its receptors.Nat Med，2003，9（6）：669-676

［6］Takahashi Y，Kitadai Y，Bucana CD，et al.Expression of vascular Endothelial growth factor and its receptor，KDR，correlates with vascularity，metastasis and proliferation of human colon cancer.Cancer Res，1995，55（18）：3964-3968

［7］Enjoji M，Nakamuta M，Yamaguchi K，et al.Clinical significance of serum levels of vascular endothelial growth factor and its receptor in biliary disease and carcinoma.World J Gastroenterol，2005，11（8）：1167-1171

［8］Rawlings JS，Rosler KM，Harrison DA.The JAK／STAT signaling pathway.J Cell Sci，2004，11（7）：1281-1283

［9］Yang SF，Wang SN，Wu CF，et al.Altered p-STAT3（tyr705）expression is associated with histological grading and intratumour microvessel density in hepatocellular carcinoma.J Clin Pathol，2007，60（6）：642-648

［10］Gong W，Wang L，Yao JC，et al.Expression of activated signal transducer and activator of transcription 3 predicts expression of vascular endothelial growth factor in and angiogenic phenotype of human gastric cancer.Clin Cancer Res，2005，11（4）：1386-1393

［11］Achcar Rde O，Cagle PT，Jagirdar J.Expression of activated and latent signal transducer and activator of transcription 3in 303non-small cell lung carcinomas and 44malignant mesotheliomas：possible role for chemotherapeutic intervention.Arch Pathol Lab Med，2007，131（9）：1350-1360

［12］Jing N，Tweardy DJ.Targeting Stat3in cancer therapy.Anticancer Drugs，2005，16（6）：601-607

［13］Wei D，Le X，Zheng L，et al.STAT3activation regulates the expression of vascular endothelial growth factor and human pancreatic cancer angiogenesis and metastasis.Oncogene，2003，22（3）：319-329

［14］Jung JE，Lee HG，Cho IH，et al.STAT3is a potential modulator of HIF-1-mediated VEGF expression in human renal carcinoma cells.FASEB J，2005，19（10）：1296-1298