吳志軍，王艷紅，阮洪生，黃玉蘭

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

生物表面活性劑是一類由微生物產(chǎn)生的能顯著改變界面表面張力的兩性化合物，同時具有親水和疏水基團[1]。能產(chǎn)生表面活性劑的微生物種類主要有枯草芽孢桿菌、假單胞菌、乳酸菌和假絲酵母等[2]。與化學(xué)表面活性劑相比，生物表面活性劑由于其具有可降解、毒性低、使用范圍廣、效率高等優(yōu)點[3]，在食品、藥品、化妝品、化工、生物修復(fù)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[2,4]。響應(yīng)面試驗設(shè)計方法是將數(shù)學(xué)與統(tǒng)計學(xué)相結(jié)合的一種有效試驗設(shè)計方法[5]，能夠通過少數(shù)幾次試驗建立數(shù)學(xué)模型，并對模型進行分析優(yōu)化，找到各因素最佳水平組合[6，7]。本文采用中心組合試驗設(shè)計（CCD）和響應(yīng)面分析方法，對產(chǎn)生物表面活性劑的枯草芽孢桿菌發(fā)酵過程進行優(yōu)化，以期達到最佳生產(chǎn)條件，為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

菌株:枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis-1101從石油中分離出的，由本實驗室保存。

LB 種子培養(yǎng)基（g·L-1）：NaCl10，胰蛋白胨 10，酵母提取物 5g·L-1；

發(fā)酵培養(yǎng)基：參考畢思寧等人[8]的培養(yǎng)方法。

培養(yǎng)基包括以下成分（g·L-1）：NaNO31.5、（NH4）2SO41.5、K2HPO41.3、MgSO4·7H2O 0.5、KCl 0.5、FeSO4·7H2O 0.01、CaCO30.002、液體石蠟5%。以上成分按試驗方案配置后在121℃滅菌20min。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1800型紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；HZQ-C空氣浴振蕩器（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）。

1.3 培養(yǎng)方法

將在種子培養(yǎng)基培養(yǎng)8h的發(fā)酵液按照5%接種量加入到裝有一定新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中。在一定溫度、pH值、搖床轉(zhuǎn)速170r·min-1下培養(yǎng)48h。

1.4 表面活性劑測定方法

參考畢思寧等人的排油圈檢測法[8]，采用蘇丹紅III染色，將0.5g蘇丹紅III溶于100mL液體石蠟，攪拌均勻后，過濾除去雜質(zhì)。取10mL蘇丹紅III染色的液體石蠟加入盛有40mL蒸餾水的直徑9cm培養(yǎng)皿中。用微量移液器加入1mL發(fā)酵液，測量排油圈直徑。每個處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 CCD試驗設(shè)計

選取影響表面活性劑產(chǎn)生的溫度、初始pH值、裝液量3個因素為考察變量，采用3因素5水平的中心組合試驗設(shè)計，共進行20次試驗。各因素編碼與水平見表1。

表1 試驗變量與編碼水平Tab.1 Experimental variables and levels of variables

按照CCD試驗設(shè)計方案進行實驗，應(yīng)用Design Expert軟件設(shè)計試驗方案和數(shù)據(jù)分析。試驗方案與結(jié)果見表2。

2.2 CCD試驗結(jié)果分析

利用Design-Expert軟件對CCD試驗結(jié)果進行二次回歸擬合，得到排油圈直徑與培養(yǎng)溫度、初始pH值和裝液量之間的回歸模型：Y=6.96-0.20A-0.11B-0.035C-0.12AB+0.024AC+0.026BC-0.21A2-0.46B2-0.12C2對模型進行方差分析，結(jié)果見表3。

方差分析結(jié)果表明，模型的顯著性P=0.0006，R2=0.9071，失擬項不顯著，說明模型擬合效果較好，實驗誤差較小，模型選擇正確。從表3還可以看出，在影響排油圈直徑大小的三個因素中，培養(yǎng)溫度和初始pH值對目標(biāo)響應(yīng)值有顯著影響，并且具有較強的二次效應(yīng)。三個因素之間的交互作用均不顯著。這個也可以從圖1～3中的等高線圖和響應(yīng)面圖中看出。

表2 CCD試驗設(shè)計方案與試驗結(jié)果Tab.2 CCD matrix of three variables with results

表3 模型的方差分析結(jié)果Tab.3 ANOVA results of the model

圖1 溫度和初始pH值對排油圈直徑影響的等高線圖與響應(yīng)面圖Fig.1 Response surfaces and contour curves of the interaction with temperature and initial pH on biosurfactant production.

圖2 溫度與裝液量對排油圈直徑影響的等高線圖與響應(yīng)面圖Fig.2 Response surfaces and contour curves of the interaction with temperature and liquid volume in flask on biosurfactant production.

圖3 初始pH值與裝液量對排油圈直徑影響的等高線圖與響應(yīng)面圖Fig.3 Response surfaces and contour curves of the interaction with initial pH and liquid volume in flask on biosurfactant production

2.3 發(fā)酵過程優(yōu)化

為了取得菌株產(chǎn)表面活性劑的最佳培養(yǎng)條件，利用Design-Expert軟件對回歸模型進行優(yōu)化求極值。預(yù)測得到最優(yōu)發(fā)酵條件為：溫度29.1℃，初始pH值為4.9，裝液量為56mL。在此條件下進行驗證，得到排油圈直徑大小為7.08cm，與預(yù)測值接近，說明模型具有較好的預(yù)測能力。

3 結(jié)論

本文以提高Bacillus subtilis-1101生物表面活性劑產(chǎn)量為目的，通過中心組合試驗設(shè)計和響應(yīng)面分析方法對其發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，產(chǎn)表面活性劑的最佳發(fā)酵條件為溫度29.1℃，初始pH值為4.9，裝液量為56mL。在此條件下得到最大排油圈直徑為7.08cm，與預(yù)測值接近。說明響應(yīng)面方法是優(yōu)化生物過程的有效工具，也為生物表面活性劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

［1］Vaz,D.A.,Gudina,E.J.,Alameda,E.J.,Teixeira,J.A.,et al.Performance of a biosurfactant produced by a Bacillus subtilis strain isolated from crude oil samples as compared to commercial chemical surfactants［J］.Colloids and Surfaces B-Biointerfaces,2012,89:167-174.

［2］Thavasi,R.,Jayalakshmi,S.,Banat,I.M.Application of biosurfactant produced from peanut oil cake by Lactobacillus delbrueckii in biodegradation of crude oil［J］.Bioresource Technology,2011,102（3）:3366-3372.

［3］Yin,H.,Qiang,J.,Jia,Y.,Ye,J.,et al.Characteristics ofbiosurfactant produced byPseudomonas aeruginosa S6 isolated from oil-containingwastewater［J］.Process Biochemistry,2009,44（3）:302-308.

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［5］Montgomery,D.C.,DesignandAnalysisofExperiments［M］.NewYork:John Wileyand Sons,2000.

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［8］畢思寧,王彥杰,左豫虎.生物表面活性劑排油圈檢測方法的改進和應(yīng)用［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報,2010,21（6）:58-60.