朱智耀，高彥彬，鄒大威，李步滿，彭繼升

糖尿病周圍神經(jīng)病變(Diabetic peripheral neuropathy DPN)是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥之一。其發(fā)病機(jī)制目前有多種學(xué)說，其中氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡在DPN的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［1-3］。中藥復(fù)方糖絡(luò)寧治療DPN的療效在臨床和實(shí)驗(yàn)研究中已得到初步證實(shí)［4-8］。本實(shí)驗(yàn)通過觀察糖絡(luò)寧對(duì)糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)細(xì)胞凋亡、半胱天冬酶-3(Caspase-3)蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討其治療DPN的作用機(jī)制，為更好地指導(dǎo)臨床用藥提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF/VAF級(jí)雄性8周齡 SD大鼠，體重180g～220g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供。分籠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境溫度控制在 20℃ ～25℃，相對(duì)濕度 40% ～70%，12/12h光照/黑暗循環(huán)。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由進(jìn)水和進(jìn)食。

1.2 藥物

中藥制劑糖絡(luò)寧浸膏(主藥為生黃芪、生地、牛膝、狗脊、丹參、川芎等)由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院制劑中心提供，1ml浸膏含生藥3g。

1.3 試劑

鏈脲佐菌素為美國(guó) Sigma公司，兔抗大鼠Caspase-3多克隆抗體為美國(guó) Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品，原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒為Roche公司產(chǎn)品(天津?yàn)笊锓盅b)，兩步法免疫組化檢測(cè)試劑盒、DAB顯色試劑盒、Mayor，s蘇木素均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.4 儀器

Olympus BX51顯微鏡、Olympus DP71攝像系統(tǒng)、穩(wěn)豪血糖儀以及血糖試紙(美國(guó)LifeScan，Inc)。

2 方法

2.1 模型建立與分組處理

選用雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)選擇8只為正常對(duì)照(control)組，其余大鼠禁食不禁水12h后，將鏈脲佐菌素(STZ)溶入檸檬酸緩沖液(p H值=4.2～4.5)配制成1%的溶液，按60mg/kg給予一次性腹腔注射(control組大鼠注射等體積的檸檬酸緩沖液)。72h后大鼠禁食8h斷尾取血，測(cè)血糖≥16.7mmol/L視為糖尿病造模成功，造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組(model)、糖絡(luò)寧組(TLN)，每組8只，隨即開始灌胃。糖絡(luò)寧組按生藥10g/(kg·d)灌胃，模型組給予等量蒸餾水灌胃，連續(xù)給藥32周。

2.2 一般情況觀察與血糖測(cè)定

觀察各組大鼠毛色、精神狀態(tài)、攝食量、飲水量、尿量、日常活動(dòng)情況等;禁食8h后尾靜脈采血，4周測(cè)定1次血糖。

2.3 免疫組化檢測(cè)DRG中Caspase-3表達(dá)

切片脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗后滴加封閉液，室溫孵育10 min甩去多余液體。滴加1∶150稀釋的一抗(Caspase-3多克隆抗體)，4℃過夜(并同時(shí)用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照)。次日PBS沖洗，滴加聚合HRP標(biāo)記抗兔IgG，37℃孵育30 min，PBS沖洗，DAB顯色，自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染、脫水透明、封片。從Caspase-3在背根神經(jīng)節(jié)中表達(dá)結(jié)果判斷，清晰的背景上胞質(zhì)和(或)核棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)，陰性對(duì)照無(wú)特異性著色。

2.4 DNA末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

切片脫蠟至水，蛋白酶 K室溫消化30min后，PBS洗片，與阻斷劑(0.3%H2O2甲醇溶液)室溫孵育30 min，PBS洗片。滴加50ul的 TUNEL反應(yīng)混合溶液，在濕盒中37℃孵育60 min，PBS沖洗后加入50ul轉(zhuǎn)化劑-POD，在濕盒中 37℃孵育 30 min，PBS沖洗3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明、封片。光鏡下觀察細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒者為TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞。

2.5 圖像分析

每張切片在400倍光鏡下選取4個(gè)互不重疊的視野，使用Image Pro-Plus 5.0.1圖像分析軟件半定量測(cè)定每個(gè)視野中所有陽(yáng)性像素的積分光密度值(IOD)，取均值為Caspase-3的結(jié)果;TUNEL結(jié)果用凋亡神經(jīng)元的陽(yáng)性百分率表示，取均值為TUNEL的結(jié)果。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示，多組均數(shù)比較采用方差分析，所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS13.0軟件處理，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況觀察

正常組大鼠精神狀態(tài)良好，毛色有光澤，進(jìn)食和飲水量以及尿量都正常，體重增加明顯，活動(dòng)自如。模型組大鼠進(jìn)食和飲水量以及尿量都明顯增多，神態(tài)萎靡，毛豎無(wú)光澤，尾巴蒼白濕冷，蜷臥拱背，活動(dòng)少，體重增長(zhǎng)緩慢。糖絡(luò)寧治療組的大鼠表現(xiàn)與模型組類似，但程度較輕。

3.2 糖絡(luò)寧對(duì)大鼠血糖值的影響

表1顯示，與正常對(duì)照組比較，造模后大鼠血糖明顯升高(P＜0.05)，同時(shí)在未進(jìn)行糖絡(luò)寧干預(yù)前(0周)，TLN組與模型組血糖值無(wú)差異(P＞0.05)。在TLN干預(yù)8周后大鼠血糖開始下降，與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

表1 糖絡(luò)寧對(duì)大鼠血糖值的影響

3.3 糖絡(luò)寧對(duì)大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元凋亡陽(yáng)性率的影響

表2圖1顯示，模型組背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的凋亡率與正常對(duì)照組相比明顯增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);糖絡(luò)寧組的凋亡率低于模型組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

圖1 背根神經(jīng)節(jié)TUNEL染色圖片(×400)

3.4 糖絡(luò)寧對(duì)大鼠背根神經(jīng)節(jié)Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

表2圖2顯示，Caspase-3免疫組織化學(xué)染色顯示在正常大鼠背根神經(jīng)節(jié)中僅有少量陽(yáng)性反應(yīng)。模型組染色呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，棕黃色顆粒狀彌漫分布于胞漿中。經(jīng)圖像分析處理，模型組積分光密度值與正常對(duì)照組相比明顯增多，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。糖絡(luò)寧干預(yù)后，大鼠背根神經(jīng)節(jié)Caspase-3的表達(dá)減少，其積分光密度值與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

4 討論

細(xì)胞凋亡主要通路分別為死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑(外在途徑)和線粒體凋亡途徑(內(nèi)在途徑)［9］，內(nèi)外途徑都是通過激活caspase家族引起細(xì)胞凋亡，在caspase蛋白家族中caspase-3又是研究的焦點(diǎn)，幾乎有關(guān)caspase的所有凋亡途徑最終都是通過激活caspase-3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［10］。Caspase-3酶原激活后可切割不同底物，形成蛋白酶級(jí)聯(lián)切割放大機(jī)制，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)和生化特征的形成。細(xì)胞凋亡的生化學(xué)特征主要是細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)在核小體間斷裂［11］，產(chǎn)生若干大小不一的寡核苷酸片段。TUNEL檢測(cè)是1種將細(xì)胞凋亡時(shí)DNA斷端進(jìn)行標(biāo)記的方法，它的檢測(cè)原理是熒光素標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶的作用下連接到凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3-OH末端，而熒光素能被結(jié)合有過氧化物酶的抗熒光素抗體識(shí)別，最后利用過氧化物酶與其底物反應(yīng)而標(biāo)記出凋亡的細(xì)胞核。該方法是最為常用的檢測(cè)凋亡手段之一，優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，特異性強(qiáng)，可原位顯示凋亡細(xì)胞及其分布。

表2 糖絡(luò)寧對(duì)大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元凋亡陽(yáng)性率及Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

圖2 背根神經(jīng)節(jié)Caspase-3蛋白表達(dá)圖片(×400)

糖尿病周圍神經(jīng)病變是多因素共同作用的結(jié)果，細(xì)胞凋亡在DPN的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。關(guān)于DPN細(xì)胞凋亡的研究主要集中在背根神經(jīng)節(jié)和坐骨神經(jīng)，本研究以背根神經(jīng)節(jié)為主。Srinivasan等［12］認(rèn)為，糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的增加是DPN的致病因素。Schmeichel等［13］研究也發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠隨病程的延長(zhǎng)，DRG神經(jīng)元凋亡率逐漸上升，且Caspase-3蛋白表達(dá)和DRG神經(jīng)元凋亡與DNA氧化損傷存在明顯相關(guān)性，支持氧化損傷導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。另外，通過體外對(duì)DRG神經(jīng)元的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)基中葡萄糖增加，神經(jīng)突的退變和細(xì)胞凋亡增加［14］。在本實(shí)驗(yàn)中，模型組同樣也出現(xiàn)DRG中Caspase-3表達(dá)增加、神經(jīng)元凋亡率上升的現(xiàn)象，在應(yīng)用糖絡(luò)寧干預(yù)后細(xì)胞凋亡有明顯改善，提示糖絡(luò)寧有抑制凋亡的作用。另外，本實(shí)驗(yàn)還觀察到糖絡(luò)寧有一定降低大鼠血糖的功效。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于DPN的治療尚無(wú)理想方法。糖絡(luò)寧以生黃芪、生地、牛膝、狗脊、丹參、川芎等為主要組成，具有益氣養(yǎng)陰、滋補(bǔ)肝腎、活血通絡(luò)之效。經(jīng)多年臨床驗(yàn)證，可以明顯改善患者肢體麻木、疼痛、反射減弱等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，對(duì)神經(jīng)傳導(dǎo)速度、末梢微循環(huán)積分以及患者氧化應(yīng)激狀態(tài)均有改善作用，在治療過程中未見明顯的不良反應(yīng)［4、5］。同時(shí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，糖絡(luò)寧可有效提高糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度，改善糖尿病大鼠的痛覺異常以及氧化應(yīng)激狀態(tài)［6、8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糖絡(luò)寧能抑制DRG中神經(jīng)元凋亡，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用，這可能為DPN治療提供新思路，為DPN臨床防治用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但糖絡(luò)寧是通過何種凋亡通路發(fā)揮作用有待進(jìn)一步研究。

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