邱梅婷

近年來，有研究中發(fā)現(xiàn)，人類白細(xì)胞抗原G(human leucocyte antigen protein G，HLA-G)是一種非經(jīng)典性的MHC-I類的分子，其具有7種蛋白異構(gòu)體，其中包括有三種可溶性的HLAG5、G6、G7分子和四種模型:HLA-G1、G2、G3、G4。HLA-G在人體內(nèi)的分布局限，一般在胎盤的絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞中為高表達(dá)，具有顯著的免疫抑制功能，主要通過參與母胎的免疫耐受從而形成人白細(xì)胞抗原G，即HLA-G。本文通過觀察分析HLA-G在結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)意義，總結(jié)應(yīng)用價(jià)值，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2007年3月至2011年3月結(jié)直腸癌患者24例，男14例，女10例;年齡45～78歲，平均年齡(54.1±0.7)歲，按照結(jié)直腸癌國際的INM分期標(biāo)準(zhǔn)［1］，分為Ⅰ級2例，Ⅱ級3例，Ⅲ級8例，Ⅳ級7例，對其組織標(biāo)本的免疫組化檢測結(jié)果進(jìn)行回顧性分析。

1.2 儀器與試劑 酶標(biāo)儀(芬蘭雷勃公司生產(chǎn)，型號:Wellscan MK3)，AEC底物顯色試劑盒(上海玉博生物科技有限公司公司提供)，ELISA的試劑盒(上海實(shí)業(yè)科華生物技術(shù)有限公司提供)，具體操作步驟嚴(yán)格遵守說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 檢驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本制作:將24例結(jié)直腸癌的活檢組織作為研究組，取其距離腫瘤附近3～5 cm的直腸組織作為陰性參照組，再取21例妊娠周期在6周內(nèi)行人工流產(chǎn)孕婦的滋養(yǎng)層細(xì)胞組織作為陽性參照組，在4℃下，以4%的多聚甲醛浸泡過夜，固定后，再經(jīng)脫水、浸臘、以石蠟包埋等處理，制成組織切片。

1.3.2 ELISA法檢測HLA-G表達(dá):將切片置于50～60℃的烤箱內(nèi)30 min，再以二甲苯脫蠟，經(jīng)各級乙醇溶液進(jìn)行水洗，再用磷酸緩沖液(PBS)反復(fù)沖洗3次，每次3 min，加入鼠抗人HLAG蛋白單克隆抗體以1∶1 000的工作濃度，在4℃下過夜或在37℃下孵育25～35 min，再次用磷酸緩沖液(PBS)反復(fù)沖洗3次，每次3 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，在37℃下孵育25～35 min，第三次用磷酸緩沖液(PBS)反復(fù)沖洗3次，每次3 min，加入AEC+底物后，在室溫下孵育5～30 min，第四次用磷酸緩沖液(PBS)反復(fù)沖洗3次，每次3 min，加入邁耶(Mayer)氏蘇木素染液后，在室溫下孵育2～5 min，沖洗后，以水溶性樹脂膠進(jìn)行封片［2］。

1.4 檢驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 參考CamsellaED中的判斷標(biāo)準(zhǔn)［3］，陽性表達(dá):結(jié)直腸癌的細(xì)胞膜及核漿可見有紅色的顆粒，并以10個高倍視野下，可隨機(jī)觀察到陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)占總細(xì)胞計(jì)數(shù)的百分比，判斷為HLA-G表達(dá)率。再依據(jù)切片中的癌細(xì)胞陽性情況與陽性細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的百分?jǐn)?shù)，可將檢測結(jié)果分為4個級別，Ⅳ級:HLA-G高表達(dá)(+++)，陽性細(xì)胞數(shù)在50%以上;Ⅲ級:HLA-G中度表達(dá)(++)，陽性細(xì)胞數(shù)在25%～50%;Ⅱ級:HLA-G低度表達(dá)(+)，陽性細(xì)胞數(shù)在20%以內(nèi);Ⅰ級: HLA-G無表達(dá)(-)，無陽性細(xì)胞。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

HLA-G在結(jié)直腸癌組織的免疫組化檢驗(yàn)結(jié)果中表達(dá)為陽性反應(yīng)的物質(zhì)呈現(xiàn)紅色，為顆粒狀或質(zhì)狀;其表達(dá)位置主要在細(xì)胞膜或細(xì)胞漿上，陽性表達(dá)率為41.7%(10/24)，強(qiáng)陽性占40.0%(4/10)，中度陽性占50.0%(5/10)，弱陽性占10.0% (1/10)，其余均為陰性。HLA-G在不同的TNM分期及不同的組織學(xué)分級中的表達(dá)存在一定的差異(χ2=9.31，15.62，P＜0.01)。見表1。

表1 HLA-G在不同的TNM分期及不同的組織學(xué)分級中的表達(dá)比較例

3 討論

本文中統(tǒng)計(jì)學(xué)發(fā)現(xiàn)，HLA-G表達(dá)位置主要在細(xì)胞膜或細(xì)胞漿上，陽性表達(dá)率為41.7%(10/24)，強(qiáng)陽性占40.0%(4/10)，中度陽性占50.0%(5/10)，弱陽性占10.0%(1/10)，其余均為陰性。HLA-G在不同的TNM分期及不同的組織學(xué)分級中的表達(dá)存在一定的差異，表明HLA-G可能與腫瘤細(xì)胞對機(jī)體的細(xì)胞免疫轉(zhuǎn)換為體液免疫的誘發(fā)機(jī)制有關(guān)。有研究中指出，機(jī)體的免疫功能在結(jié)直腸癌的發(fā)生級進(jìn)展中，會逐步下降，并且其下降幅度與細(xì)胞因子的分泌模式強(qiáng)勢漂移至Th2有一定關(guān)系，而HLA-G則對細(xì)胞因子的分泌模式有影響，能誘導(dǎo)Thl/Th2的細(xì)胞因子趨于平衡，并往Th2的方向進(jìn)行漂移，引起Th2型的細(xì)胞因子中的IL-12、IL-10分泌明顯增加，從而使機(jī)體抗腫瘤的免疫抵抗能力下降［4］。因此，臨床中認(rèn)為上述研究結(jié)論很可能是HLA-G的高表達(dá)與結(jié)直腸癌發(fā)生侵襲性生長時(shí)出現(xiàn)明顯相關(guān)性的原因。

綜上所述，HLA-G在結(jié)直腸癌患者中可能與其發(fā)生及發(fā)展有一定的關(guān)系，由其表達(dá)意義引起的腫瘤細(xì)胞免疫逃逸屬于體液免疫和細(xì)胞免疫的復(fù)雜生理過程，因此，HLA-G在結(jié)直腸癌組織的免疫組化檢驗(yàn)結(jié)果對防治結(jié)直腸癌有重要的臨床指導(dǎo)意義。

1 花瞻.HLA-G與腫瘤免疫逃逸.中國腫瘤生物治療雜志，2008，10: 292-294.

2 朱成寶，王傳新，張建，等.人白細(xì)胞抗原G在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義.生物技術(shù)通訊，2009，20:208-210.

3 Carosella ED，Horuzsko A.HLA-G and cancer.Semin Cancer Biol，2007，17:411-412.

4 劉新純，姚聯(lián)波，廖茂湖，等.結(jié)直腸癌IL-10和IL-12的檢測及意義.結(jié)直腸肛門外科，2008，14:32-33.