王 皓,劉 秋,孫建龍,閆建芳,趙柏霞,劉志恒

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院,遼寧 沈陽 110161;2.大連民族學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,遼寧 大連 116600)

很多放線菌能夠產(chǎn)生具有廣譜殺菌效果的次生代謝產(chǎn)物。據(jù)不完全統(tǒng)計,放線菌產(chǎn)生的活性次生代謝產(chǎn)物約占目前已發(fā)現(xiàn)微生物活性次生代謝產(chǎn)物的50%[1]。海洋微生物具有不同于陸地微生物的代謝途徑,可產(chǎn)生完全不同于陸地微生物的新穎生物活性物質(zhì)[2],因此海洋放線菌在新型抗生素以及生物農(nóng)藥的開發(fā)等方面具有巨大潛力。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大腸桿菌(Escherichia coli)是導(dǎo)致食品污染和人類感染的主要細菌,而它們又分別是 G+和 G—的代表菌。鐮刀菌屬真菌(Fusarium moniliforme)是植物產(chǎn)后病害的重要病原菌之一,危害水稻、小麥、玉米等作物,造成嚴(yán)重減產(chǎn),其中一些菌種也可引起人類疾病,且有致癌作用[3]。選用上述 3種菌為供試菌株,通過對海洋沉積物中分離得到的海洋放線菌抑菌活性測定,篩選到一株海洋放線菌 YH91,其發(fā)酵液能夠抑制所選供試病原菌,并且抑菌活性穩(wěn)定。通過對該菌株的鑒定及其抑菌活性的研究,為下一步代謝產(chǎn)物的研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

采集遼寧省大連市龍王塘西口距離海岸 300 m的海洋沉積物,從中分離得到海洋放線菌 YH91,于-80℃冰箱中凍干保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌種鑒定培養(yǎng)基：高氏一號培養(yǎng)基、蔗糖硝酸鹽瓊脂培養(yǎng)基、燕麥粉瓊脂培養(yǎng)基、無機鹽淀粉瓊脂培養(yǎng)基、甘油天冬素瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯塊培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、淀粉瓊脂培養(yǎng)基;發(fā)酵培養(yǎng)基：高氏一號液體培養(yǎng)基;抗菌活性測定培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)基的配方參照文獻[4-5]。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)特征以及培養(yǎng)特征研究

用高氏一號培養(yǎng)基劃線埋片,于28℃下培養(yǎng)5 d后,用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察菌株 YH91形態(tài)特征。于 7種菌種鑒定培養(yǎng)基分別劃線,在 28℃下培養(yǎng)7 d,進行培養(yǎng)特征觀察。

1.2.2 生理生化特性

參照文獻[6-8]進行生理生化特性鑒定。

1.2.3 細胞壁化學(xué)組分分析

全細胞壁氨基酸和全細胞水解產(chǎn)物糖組份分析采用Stanek等[9]和王平[10]的的快速薄板層析法(TLC)進行。

1.2.4 16S rDNA的擴增及其同源性比較

用微波法[11]進行放線菌總DNA的提取。以培養(yǎng)至對數(shù)期的新鮮菌絲體基因組DNA為模板,采用原核生物通用引物F27及R1492(由上海生工公司合成)進行16S rDNA序列擴增,引物序列為F27：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;R1492：5’-TACCTTGTTACGACTT-3’,PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件見參考文獻[12],用1%瓊脂糖凝膠電泳進行PCR產(chǎn)物檢測。采用DNA純化試劑盒(寶生物(大連)工程技術(shù)有限公司)進行 PCR擴增產(chǎn)物的回收pMD19-T克隆試劑盒(寶生物(大連)工程技術(shù)有限公司)進行 PCR擴增產(chǎn)物的連接以及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化,由北京三博遠志生物公司進行16S rDNA 序列分析。將所測得的YH91的16S rDNA序列同NCBI數(shù) 據(jù) 庫 (http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)中 已有序列進行比對分析,利用MEGA5.0軟件構(gòu)建N-J(Neighbor-joining)系統(tǒng)進化樹,確定菌株的分類地位。

1.2.5 抑菌物質(zhì)活性測定

用接種針取YH91孢子接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,于28℃ 150 r/min培養(yǎng)7 d制備菌株YH91發(fā)酵液,發(fā)酵液在8 000 r/min條件下離心5 min。上清液過0.45 μm濾膜,采用管碟法[13]測定上清液對3種指示菌的抑菌活性。

1.2.6 抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性研究

取5 mL(原始PH 7)YH91發(fā)酵上清液9份,進行9種處理,Ⅰ：未處理作為對照;Ⅱ：100℃,0.5 h;Ⅲ：pH 2,24h;Ⅳ：pH 12,24 h;Ⅴ：pH 2,24 h,再 100℃,0.5 h;Ⅵ：pH 12,24 h,再 100℃,0.5 h;Ⅶ：紫外照射0.5 h;Ⅷ：紫外照射 1 h;Ⅸ：紫外照射 3 h。檢測上清液的抑菌活性,以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及鐮刀菌屬作為指示菌,細菌于 37℃培養(yǎng) 24 h,真菌于28℃培養(yǎng)60 h,記錄抑菌結(jié)果并進行顯著性檢驗。熱處理部分在恒溫水浴鍋中進行,pH調(diào)節(jié)采用3 mol/L HCL和3 mol/L NaOH;所有試驗設(shè)3個重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)特征

取 YH91玻片在光學(xué)顯微鏡下觀察,其基內(nèi)菌絲細長多分支,色澤淺而透明,相互交織成網(wǎng)狀。電子顯微鏡觀察孢子絲呈不規(guī)則分枝狀,孢子卵圓或圓形, 孢子之間無縊縮, 大小為 (0.8～1.1)μm×(1.1～1.4)μm,孢子表面有紋飾(圖1)。

圖1 菌株YH91的掃描電鏡圖(×7 000)Fig.1 Scanning electron micrograph of strain YH91(×7 000)

2.2 培養(yǎng)特征

利用不同培養(yǎng)基培養(yǎng),YH91產(chǎn)生的氣生菌絲與基內(nèi)菌絲的顏色各不相同,均不產(chǎn)生可溶性色素,除在馬鈴薯塊培養(yǎng)基上長勢一般外,在其余培養(yǎng)基長勢良好。具體結(jié)果見表1。

表1 菌株YH91的培養(yǎng)特征Tab.1 Cultural characteristics of strain YH91

2.3 生理生化特性

YH91菌株能液化明膠、還原硝酸鹽、不胨化牛奶、不水解淀粉、不水解纖維素、不產(chǎn)生黑色素,不產(chǎn)硫化氫。能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、甘露醇,不利用果糖、蔗糖、木糖、棉子糖、肌醇。YH91與淀粉酶鏈霉菌(S.diastaticus)具體形態(tài)特征及生理生化特征的比較見表2。

2.4 細胞壁化學(xué)類型

經(jīng)TLC全細胞水解液分析發(fā)現(xiàn),菌株YH91細胞壁組成中含 L,L-DAP;有葡萄糖,無阿拉伯糖、甘露糖、木糖和馬杜拉糖等特征性糖。其細胞壁氨基酸型為I型,糖型為C型。符合鏈霉菌屬(Streptomyces)的化學(xué)分類特性。

表2 菌株YH91形態(tài)特征及生理生化特征Tab.2 Morphological characteristics and physiological and biochemical properties of strain YH91

2.5 16S rDNA的擴增及序列分析

菌株YH91的16S rDNA序列長度為1 450 bp,NCBI的序列登記號為：JN205799.將所測序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)菌種進行比較,其與Streptomyces diastaticus subsp.ardesiacus的序列相似性為99.4%。構(gòu)建以16S rDNA全序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果如圖2所示。

圖2 菌株YH91系統(tǒng)進化發(fā)育樹Fig.2 Rooted phylogenetic tree of strain YH91

2.6 抑菌物質(zhì)活性分析

由圖3可見,YH91的發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及鐮刀菌都具有明顯的抑制作用,抑菌圈直徑分別達到32、34和29 mm,說明該活性物質(zhì)為一類廣譜抗生素。

圖3 YH91對不同病原菌的抑制結(jié)果Fig.3 Bacteriostatic activities of strain YH91 to different bacteria

2.7 抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性分析

由表3可見,發(fā)酵液在經(jīng)過酸、堿、高溫及紫外照射處理后,抑菌圈直徑大小沒有明顯改變。在0.05水平進行顯著性檢驗,結(jié)果顯示其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用經(jīng)堿處理后略有下降,對鐮刀菌的抑制作用經(jīng)酸處理后略有下降,其余各組與未經(jīng)處理的上清液無顯著差異。說明鏈霉菌YH91所產(chǎn)生的活性物質(zhì)對酸、堿、熱以及紫外照射的穩(wěn)定性較好。

表3 YH91抗菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性試驗結(jié)果Tab.3 The stabilities of the antimicrobial substances produced by strain YH91

3 討論

據(jù) Pridham 等[14]的報道,S.diastaticus subsp.ardesiacus的孢子絲螺旋形,孢子表面光滑,氣生菌絲為石板灰色,基絲無色,能水解淀粉,能使牛奶凝固并胨化,不能液化明膠：而菌株YH91的孢子絲為不規(guī)則分枝,孢子表面有紋飾,氣生菌絲為淺粉色、乳白色或灰白色,基內(nèi)菌絲為淡紫色或粉色,不能水解淀粉,能凝固牛奶但不能使牛奶胨化,能液化明膠。綜上所述,菌株YH91與S.diastaticus subsp.ardesiacus的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及生理生化特性存在較大的差異。因而認為菌株YH91為S.diastaticus subsp.ardesiacus的一株亞種。

目前,從天然資源中尋找活性物質(zhì)代替化學(xué)農(nóng)藥以及開發(fā)天然抗菌化合物已成為研究的重點[15]。海洋放線菌 YH91的發(fā)酵液能夠有效抑制金黃色葡萄球菌(S.aureus)、大腸桿菌(E.coli)以及鐮刀菌(F.moniliforme)的生長,經(jīng)酸、堿、熱及紫外線的處理之后,抑菌物質(zhì)的活性受到的影響較小,表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性,在生物防治以及醫(yī)藥研究等方面的研究具有潛在價值,其活性物質(zhì)的分離、純化和結(jié)構(gòu)解析等研究正在進行中。

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