仝甲釗，曲 波，金世柱

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江哈爾濱150086

長期以來，食管放射性損傷是頭、頸及胸部惡性腫瘤放射治療的重要并發(fā)癥之一［1］。目前臨床上主要采取對癥支持治療，此類方法雖可有效緩解部分癥狀，但其遠期療效欠佳，不良反應(yīng)亦較為明顯［2］，尤其對晚期放射性食管損傷本身的病變來說并無有效的幫助。因此如何使嚴(yán)重?fù)p傷的食管上皮重新修復(fù)，并恢復(fù)功能，避免形成狹窄，一直是亟待解決的難題。過去的研究主要集中在止痛解痙、抗菌消炎、保護消化道黏膜的對癥處理上［1］，而這些方法并不能從根本上解決問題。如今，干細(xì)胞移植治療組織器官損傷的研究方興正艾，并已取得良好的成效，因此應(yīng)用干細(xì)胞移植治療食管放射性損傷為我們指出了一個新的研究方向。

1 干細(xì)胞移植治療食管放射性損傷的理論基礎(chǔ)

1.1 干細(xì)胞的特性及分類 干細(xì)胞是一類未充分分化的多潛能細(xì)胞，它不僅能自我更新，而且在一定條件下能誘導(dǎo)分化為多種成熟功能細(xì)胞［3］。通過干細(xì)胞的分化能力可以把其分為如胚胎細(xì)胞類的全能干細(xì)胞、三種胚層細(xì)胞類的多能干細(xì)胞、僅能分化為一種特定細(xì)胞類型，也叫做受約束的祖細(xì)胞的單能干細(xì)胞［4］。雖然胚胎干細(xì)胞具有分化的全能性，但由于存在倫理學(xué)、免疫排斥以及潛在的致瘤性等問題限制了它在臨床上的應(yīng)用。所以，干細(xì)胞治療放射性食管損傷的研究主要集中在食管上皮干細(xì)胞、骨髓源性干細(xì)胞等成體干細(xì)胞。

1.2 骨髓中存在的兩個獨特的干細(xì)胞群 在骨髓中存在著多種類型的細(xì)胞，包括成熟血細(xì)胞和少量的干細(xì)胞。骨髓干細(xì)胞［5］具有自我更新能力強，長期保持活性及多向分化的潛能，被稱“可塑性”。當(dāng)機體處于生理或者病理情況下，可動員骨髓干細(xì)胞釋放入周圍循環(huán)中而參與多種組織的再生。骨髓干細(xì)胞主要包括造血干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。造血干細(xì)胞在體內(nèi)主要分化成紅粒、單核系統(tǒng)，其功能主要維持體內(nèi)造血功能，在血液系統(tǒng)疾病方面研究較多，并已取得很大進步。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是骨髓中的主要支持細(xì)胞，其功能包括:通過分泌骨髓基質(zhì)，提供造血微環(huán)境;具有在一定的環(huán)境和誘導(dǎo)因子作用下，分化為肝臟、心肌、肌腱、成骨、脂肪、軟骨、血管內(nèi)皮等成熟細(xì)胞的能力［6］。

2 受輻射器官組織修復(fù)中的骨髓干細(xì)胞動員

2.1 骨髓干細(xì)胞在經(jīng)射線照射后的動物體內(nèi)的遷移分化 造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞都能通過體液循環(huán)進行遷移，并在特定的情況下顯示出增強的動員及轉(zhuǎn)移到遠組織位點的能力［7］。未受照射的骨髓區(qū)域能夠動員造血干細(xì)胞，隨后使之循環(huán)聚集，并使它們在受過照射或損傷的區(qū)域歸巢和重新增殖。Quesenberry等［8］通過對小鼠進行全身照射，破壞其造血系統(tǒng)，而僅屏蔽它的一個肢體，結(jié)果證明能使其造血系統(tǒng)完全重建和恢復(fù)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞［9］也可以從未受照射的區(qū)域遷移到遭受嚴(yán)重輻射位點，同時也有助于晚期的輻射損傷纖維化的修復(fù)，并具有顯著改善肺泡間隔纖維化損傷的功能。

2.2 骨髓干細(xì)胞的動員刺激因素 造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞群的調(diào)動受多種因素的刺激，包括細(xì)胞因子，以及涉及到輻射旁觀者效應(yīng)的某種未知的可溶性因子［10］。通常人們認(rèn)為，為身體某部位照X光時所佩帶的防護鉛板能夠保護身體的其他部位免遭輻射。然而根據(jù)研究，在將培養(yǎng)液中的細(xì)胞暴露在電離輻射下后，即便是那些沒有經(jīng)過直接照射的細(xì)胞的染色體也會受到損傷。顯然，一些經(jīng)過照射的細(xì)胞傳遞了一個惡化的信號，或者釋放了一些化學(xué)物質(zhì)，從而破壞了周圍細(xì)胞的脫氧核糖核酸，這種現(xiàn)象即稱為輻射旁觀者效應(yīng)。集落刺激因子和其他骨髓源性細(xì)胞因子也已經(jīng)表現(xiàn)出能調(diào)動造血干細(xì)胞進入人和動物的外周血［8，11］。

2.3 骨髓起源細(xì)胞在組織修復(fù)中的作用 最新證據(jù)表明骨髓源性細(xì)胞群有助于恢復(fù)性組織及上皮組織輻射后晚期纖維化的修復(fù)［12-13］。骨髓干細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)記已經(jīng)被證明與一些細(xì)胞具有相同的表型標(biāo)志物，這些細(xì)胞主要負(fù)責(zé)輻射后的肺［8］、食管和化學(xué)性毒物損傷性肝臟［14］的再生修復(fù)。骨髓源性細(xì)胞的循環(huán)聚集已經(jīng)被認(rèn)為參與腦、脊髓、皮膚以及其他器官的損傷修復(fù)，但目前尚不清楚骨髓起源細(xì)胞是否在遭受輻射的上皮組織中負(fù)責(zé)早期修復(fù)階段。

3 干細(xì)胞移植治療食管放射性損傷的基礎(chǔ)研究

3.1 人類食管上皮的最初分化形成與造成放射性食管損傷的主要影響因素 食管代表了一種與皮膚鱗狀上皮和消化道功能上皮相似的一種組織。在胚胎發(fā)育階段，人類早期妊娠胎兒擁有了腺狀形態(tài)上皮和腸上皮功能。在胎兒發(fā)育期間，開始出現(xiàn)了食管上皮到鱗狀上皮的明顯過度，并且在全部食管上擁有了天生的角化鱗狀上皮。近年來，食管起源細(xì)胞重新增殖在食管放化療損傷中的作用已經(jīng)成為一個令人感興趣的話題。隨著放化療藥物包括卡鉑、紫杉醇、依托泊苷和吉西他濱的出現(xiàn)，以及實施更先進的放射治療方法，包括強度調(diào)控放射治療，對腫瘤目標(biāo)放射劑量逐漸增加，從而達到對食管來說有意義的放射劑量，嚴(yán)重放射性食管炎得到了廣泛的報道［15］。目前，放射性食管炎仍然是非小細(xì)胞肺癌及食管癌放化療的主要并發(fā)癥，且常常由于脫水、食管潰瘍限制既定方案的完成以及放療劑量的增加［16-17］。

3.2 干細(xì)胞移植在食管放射性損傷模型中的應(yīng)用研究 近年來，通過給予輻射損傷組織局部、靜脈移植骨髓干細(xì)胞或相應(yīng)組織的起源細(xì)胞從而使這些組織重新增殖修復(fù)的研究獲得了極大的關(guān)注，同時也已經(jīng)成為一個熱門學(xué)科。

3.2.1 食管起源細(xì)胞表型分析與其在放射性食管損傷中的表達和分化:Epperly等［13］通過應(yīng)用造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物 Sca-1、Thy-1、CD45或者 c-kit的 FITC、PE或PE-Cy5共軛抗體對食管鱗狀細(xì)胞染色，斷定食管起源細(xì)胞的表面和組織化學(xué)表型，從而對食管起源細(xì)胞的表達分化進行檢測分析。然后通過Hoechst/碘化丙碇法和連續(xù)懸浮法兩種方法從成年C57BL/6JGFP陽性小鼠中分離出非黏附、圓形食管祖細(xì)胞。用Hoechst/碘化丙碇法從每個食管中能夠得到大約5×102～2×104個細(xì)胞，而用連續(xù)懸浮法則能得到8×103～5×104個細(xì)胞。然后把這些起源細(xì)胞通過靜脈移植入GFP陰性、軀體上部受過照射的小鼠體內(nèi)，在受體食管中檢測GFP陽性細(xì)胞。結(jié)果得出在注射后第14天和21天的食管鱗狀上皮層中檢測到GFP陽性位點。

Kalabis等［18］驗證了食管基底層干細(xì)胞的存在，他們應(yīng)用Hoechst染色擠壓和BrdU標(biāo)記保留分析法鑒定得出在小鼠食管中存在著一個潛在的食管干細(xì)胞群，它定位于基底細(xì)胞特定區(qū)室，具有自我更新和分化為基底上層細(xì)胞，以及始終擁有與干細(xì)胞、起源細(xì)胞相似的能力。

3.2.2 骨髓源性細(xì)胞在放射性食管損傷中的表達和分化及其他應(yīng)用:Epperly等［13］用30 Gy量的射線照射C57BL/6J雌性小鼠軀干上部中位，從而造成放射性食管炎，然后通過靜脈注射入體內(nèi)5×104～1×106個全骨髓細(xì)胞，對照組不予注射。結(jié)果顯示給予每只小鼠1×106個全骨髓細(xì)胞能夠使食管受30 Gy射線照射的小鼠免于致死性食管炎。結(jié)果還得出在單粒級高劑量照射的情況下，通過靜脈注射骨髓細(xì)胞對放射性食管炎能夠起到保護作用。

為了判定骨髓細(xì)胞是否能自然地遷移到放射損傷的食管處，使C57BL/6J雌性鼠接受10 Gy的整體照射和5×105個GFP陽性雄性骨髓細(xì)胞靜脈移植，在移植30天后，從受移植鼠身上取外周血檢測，那些表達超過50%GFP陽性循環(huán)有核細(xì)胞的小鼠被認(rèn)為成功嵌合。然后使這些鼠身體上部接受30 Gy劑量的射線照射，結(jié)果顯示出外源骨髓細(xì)胞的遷移和歸巢，并在21天后形成食管焦點，并清楚地顯示GFP和Y染色體陽性。未受照射的小鼠食管不顯示GFP陽性。這些資料表明骨髓細(xì)胞在受過照射的食管中具有一定程度歸巢、增生并形成集落的能力。

Sarosi等［19］在進行骨髓源性細(xì)胞與大鼠 Barrett食管修復(fù)及化生關(guān)系的研究中，從雄性大鼠四肢脛骨和股骨中提取骨髓細(xì)胞，分離培養(yǎng)后經(jīng)尾靜脈注入已受致死性射線劑量照射的雌性大鼠體內(nèi)，從而使大鼠骨髓和免疫系統(tǒng)得以重建，然后通過既定手術(shù)造成反流性食管黏膜損傷。結(jié)果顯示，在Barrett食管上皮中能夠發(fā)現(xiàn)由骨髓源性細(xì)胞分化而來的食管黏膜鱗狀上皮細(xì)胞，并排除其他可能混淆因素。這些結(jié)果也表明在食管損傷病理情況下，通過注射外源干細(xì)胞，能夠起到食管損傷修復(fù)的作用。通過這些研究，我們也可以得出外源干細(xì)胞移植不僅能夠?qū)κ彻芊派湫該p傷進行修復(fù)，且對食管黏膜的多種損傷都可能有修復(fù)作用。

4 目前骨髓干細(xì)胞治療食管損傷存在的問題與前景

在過去的十幾年中，干細(xì)胞的研究已經(jīng)取得了極大的進展。越來越多的研究顯示出干細(xì)胞對損傷組織包括胃腸道擁有非常大的治療潛能。然而就食管損傷模型來說，骨髓細(xì)胞是否能自然地循環(huán)到食管損傷區(qū)域并重建它，作為一種自我平衡機制或者對損傷的反應(yīng)，依然是一個未知數(shù)［13］。且目前應(yīng)用干細(xì)胞移植治療食管放射性損傷的研究過少，且多數(shù)研究的干細(xì)胞選取僅局限于組織本身的基底細(xì)胞和全骨髓細(xì)胞［13，19］，因此在放射性損傷生物學(xué)研究方面，干細(xì)胞真正應(yīng)用于臨床還有很多問題需要解決，如移植干細(xì)胞的選擇、移植后的遠期效果觀察，特別是移植后的干細(xì)胞分化為腫瘤細(xì)胞的可能性［20］等方面，均需要大樣本的資料來回答。不過目前的資料顯示外源骨髓干細(xì)胞和食管基底細(xì)胞能夠在受照射成年鼠食管的黏膜上皮表達分化。因此在不久的將來干細(xì)胞可能為上消化道損傷的治療與食管獲得性疾病提供一個有用的細(xì)胞資源。

［1］Gong LY，Ma SL.The research advance of Chinese and western medicine in radioactive esophageal injury［J］.Modern Journal of Integrated TraditionalChineseand Western Medicine， 2009，18(33):4164-4167.龔黎燕，馬勝林.放射性食管損傷的中西醫(yī)研究進展［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，18(33):4164-4167.

［2］Zhang ZR，Wang FW.The therapeutic progress of Chinese and western medicine in radioactive esophagitis［J］.Chinese Journal of Information on TCM，2010，17(3):102-103.張柱仁，王發(fā)渭.放射性食管炎中西醫(yī)治療進展［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2010，17(3):102-103.

［3］Blau HM，Brazelton TR，Weimann JM.The evolving concept of a stem cell:entity or function ［J］.Cell，2001，105(7):829-841.

［4］Alison MR，Poulsom R，F(xiàn)orbes S，et al.An introduction to stem cells［J］.J Pathol，2002，197(4):419-423.

［5］Xing NN，Li XS.Basic and clinical research of autologous bone marrow stem cells in treatment of hepatic cirrhosis［J］.Journal of Clinical RehabilitativeTissue Engineering Research， 2011， 15(36):6821-6824.邢旎旎，李孝生.自體骨髓干細(xì)胞治療肝硬化基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用現(xiàn)狀［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15(36):6821-6824.

［6］Gimble JM，Guilak F，Nuttall ME，et al.In vitro differentiation potential of mesenchymal stem cells［J］.Transfus Med Hemoth，2008，35(3):228-238.

［7］Epperly MW，Sikora CA，Defilippi S，et al.Bone marrow origin of myofibroblasts in irradiation pulmonary fibrosis［J］.Resp Am J Mol Cell Biol，2003，29(2):213-224.

［8］Quesenberry PJ，Colvin G，Abedi M.Perspective:fundamental and clinical concepts on stem cell homing and engraftment:A journey to niches and beyond ［J］.Exp Hematol，2005，33(1):9-19.

［9］Prockop DJ.Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissue［J］.Science，1997，276(5309):71-74.

［10］Blau HM，Brazelton TR，Weimann JM.The evolving concept of a stem cell:entity or function ［J］.Cell，2001，105(7):829-841.

［11］Ahmed F，Ings SJ，Pizzey AR，et al.Impaired bone marrow homing of cytokine-activated CD34+cells in the Nod/SCID model［J］.Blood，2004，103(6):2074-2084.

［12］Krause D，Theise N，Collector M，et al.Multi-organ，multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell［J］.Cell，2001，105(3):369-377.

［13］Epperly MW，Guo HL，Shen HM，et al.Bone marrow origin of cells with capacity for homing and differentiation to esophageal squamous epithelium［J］.Radiat Res，2004，162(3):233-240.

［14］Epperly MW，Sikora C，Defilippi S，et al.Manganese superoxide dismutase(SOD2)inhibits radiation-induced apoptosis by stabilization of the mitochondrial membrane［J］.Radiat Res，2002，157(5):568-577.

［15］Bhatnagar A，F(xiàn)lickinger JC，Bahri S，et al.Update on results of multifield conformal radiation therapy of non-small-cell lung cancer using multileaf collimated beams［J］.Clin Lung Cancer，2002，3(4):259-264.

［16］Epperly MW，Shen H，Jefferson M，et al.In Vitro differentiation capacity of esophageal progenitor cells with capacity for homing and repopulation of the ionizing irradiation-damaged esophagus［J］.In Vivo，2004，18(6):675-685.

［17］Movsas B，Moughan J，Sarna L，et al.Quality of life supersedes the classic prognosticators for long-term survival in locally advanced nonsmall cell lung cancer:An analysis of RTOG 9801 ［J］.J Clin Oncol，2009，27(34):5816-5821.

［18］Kalabis J，Oyama K，Takaomi T，et al.A subpopulation of mouse esophageal basal cells has properties of stem cells with the capacity for self-renewal and lineage specification［J］.J Clin Invest，2008，118(12):3860-3869.

［19］Sarosi G，Brown G，Jaiswal K，et al.Bone marrow progenitor cells contribute to esophageal regeneration and metaplasia in a rat model of Barrett’s esophagus［J］.Dis Esophagus，2008，21(1):43-50.

［20］Hutchinson L，Stenstrom B，Chen D，et al.Human Barrett’s adenocarcinoma of the esophagus，associated myofibroblasts，and endothelium can arise from bone marrow-derived cells after allogeneic stem cell transplant［J］.Stem Cells Dev，2011，20(1):11-17.