李 霞綜述 譚少健審校

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，南寧市 530027)

二維平面是最常見(jiàn)的體外細(xì)胞培養(yǎng)方式，其支持細(xì)胞生長(zhǎng)的底物是由聚苯乙烯或玻璃制成，所提供的培養(yǎng)平面是扁平的，這是絕大多數(shù)研究中細(xì)胞的生長(zhǎng)與黏附的形式。但由于二維培養(yǎng)并不能真正顯現(xiàn)組織中的細(xì)胞外基質(zhì)，很多在二維培養(yǎng)中的生理反應(yīng)，如受體表達(dá)、轉(zhuǎn)錄表達(dá)、細(xì)胞移行及凋亡已被證實(shí)和實(shí)際器官或組織所發(fā)生的情況很不一樣。而且細(xì)胞從分裂、增殖、遷徙和凋亡，是一連串被精確調(diào)控的事件，有賴于其內(nèi)部固有的空間立體及時(shí)間上的組織原則。二維培養(yǎng)被認(rèn)為是過(guò)于簡(jiǎn)單且忽略了很多精確再現(xiàn)細(xì)胞及組織生理的重要參數(shù)，包括機(jī)械信號(hào)、細(xì)胞與其基質(zhì)的通訊、細(xì)胞間通訊及不同類型的細(xì)胞間通訊，在很多二維培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中，均沒(méi)有考慮到不同類型的細(xì)胞的相互作用，二維共培養(yǎng)離準(zhǔn)確再現(xiàn)組織內(nèi)細(xì)胞的功能還是有很大距離［1］。2000年以后，越來(lái)越多的研究組將細(xì)胞的空間組織考慮入細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境中［2～4］，即進(jìn)行體外細(xì)胞的三維培養(yǎng)。這些研究的普遍共同目標(biāo)是在二維單層培養(yǎng)細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)之間建立連接的橋梁。目前，三維培養(yǎng)主要應(yīng)用于組織工程學(xué)研究。本文對(duì)三維培養(yǎng)現(xiàn)有的途徑、技術(shù)及三維培養(yǎng)在角膜組織工程學(xué)中應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 三維培養(yǎng)概況

1.1 三維培養(yǎng)模型 培養(yǎng)模式被分為:整個(gè)動(dòng)物和器官移植培養(yǎng)(包括胚胎)、細(xì)胞球、微載體培養(yǎng)及組織工程模型等［5］。并不是所有的三維培養(yǎng)都需要培養(yǎng)支架，然而在過(guò)去的10年中，支架的應(yīng)用得到了大幅度的提高。整個(gè)動(dòng)物和器官移植培養(yǎng)主要用于對(duì)于組織特異性有絕對(duì)需要的研究中。這些模型使細(xì)胞位于其天然的環(huán)境中，例如黑腹果蠅、斑馬魚(yú)及小鼠胚胎的應(yīng)用。培養(yǎng)的條件，例如pH值、溫度、氧含量必須要嚴(yán)格控制。器官培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)包括保持了組織的體系結(jié)構(gòu)，更重要的是在組織中呈現(xiàn)分化的細(xì)胞。這樣的培養(yǎng)模式，技術(shù)上要求在時(shí)間上維持標(biāo)本的完整性和可以深入樣本深部采集圖像。細(xì)胞球體是簡(jiǎn)單的三維培養(yǎng)模式，可以用于多種細(xì)胞類型及形式。他們可從單培養(yǎng)和共培養(yǎng)(如懸滴培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)、凹板培養(yǎng)等)方式構(gòu)建而成。細(xì)胞球體不需要支架，可以用光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡及共聚焦顯微鏡觀察。細(xì)胞球常常被用在固體腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的研究中，他同時(shí)也被應(yīng)用于較多的治療研究中，例如高通量篩查等。

1.2 生物學(xué)材料支架 支架的出現(xiàn)是為了提高三維培養(yǎng)模型的體積及其復(fù)雜性。除了空間的調(diào)控外，細(xì)胞的聚集還需要特別注意細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)及氣體供應(yīng)、交換。當(dāng)細(xì)胞聚集厚度達(dá)到1～2 mm時(shí)引起大分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)缺乏，而此時(shí)所發(fā)生的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物交換是有限的，因此細(xì)胞死亡會(huì)增多［6］。支架應(yīng)高度疏松，多孔，同時(shí)兼具形狀細(xì)胞黏附部位及氣體、營(yíng)養(yǎng)成分及代謝物的流動(dòng)。不同類型的細(xì)胞被植入基質(zhì)中，具有不同的特性及形狀。臨床工作的功能性植入物需要的是一個(gè)暫時(shí)性的可生物降解的支架，該支架在植入以后可以被身體重塑并由天然組織取代而重建原有功能。在這種情況下，支架必須提供細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，同時(shí)支架大小必須與其空缺部分具有物理性匹配。此外，支架必須以無(wú)毒性及無(wú)免疫原性的代謝物的形式進(jìn)行講解。三維培養(yǎng)的另一個(gè)作用是作為體外培養(yǎng)模型來(lái)進(jìn)一步了解組織生理學(xué)或作為藥物及化妝品篩查的評(píng)價(jià)系統(tǒng)［7］。這樣的情況下，三維系統(tǒng)重要的是準(zhǔn)確的復(fù)現(xiàn)自然組織的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)含有相應(yīng)的細(xì)胞，同時(shí)這些細(xì)胞得到并處于相應(yīng)分化階段。對(duì)于這種情況，更需要獲得的是應(yīng)用這些模型獲悉細(xì)胞的功能和反應(yīng)，而這些模型的支架的絕對(duì)大小及其需要的水解和降解就不顯得那么重要了。

用以搭建支架的疏松多孔材料有金屬、玻璃、聚合物及陶瓷。聚合物由于在構(gòu)建支架過(guò)程中得到聯(lián)合應(yīng)用，其可控的化學(xué)特性及結(jié)構(gòu)特性而受到普遍應(yīng)用。聚合物可以分為合成類和天然衍生類。合成類材料包括聚羥基己酸(Poly Glycolic Acid，PGA)及聚乳酸(poly lactic acid，PLA)，而天然衍生聚合物包括殼聚糖(Chitosan)及膠原。對(duì)于所有的生物材料支架的一個(gè)普遍要求，就是要再現(xiàn)一個(gè)細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境以支持細(xì)胞在體外環(huán)境中的生長(zhǎng)。

生物材料表面的化學(xué)特性對(duì)于細(xì)胞的黏附及活細(xì)胞的播散是非常重要的。這樣的化學(xué)特性并不是生物化學(xué)材料所必需，而更多的是由生長(zhǎng)培養(yǎng)基或者細(xì)胞本身提供。表面化學(xué)特性主要由電荷及極性來(lái)決定，也就是一般術(shù)語(yǔ)中所說(shuō)的控制可溶性蛋白在表面的吸引及彌散吸收。表面電荷的廣泛程度和被吸收蛋白質(zhì)的比率之間存在一定關(guān)系。這和細(xì)胞黏附于生物材料存在關(guān)系。細(xì)胞是通過(guò)被吸收的蛋白質(zhì)層來(lái)相互作用的，而不是直接和生物材料表面作用。1.3 三維結(jié)構(gòu)的生物反應(yīng)器 營(yíng)養(yǎng)供給是設(shè)計(jì)包括臨床用途及體外模型的三維培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)所需要考慮的問(wèn)題。早期簡(jiǎn)單的三維培養(yǎng)模型基于靜態(tài)的方法。然而，生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)及應(yīng)用越來(lái)越被和三維培養(yǎng)系統(tǒng)及組織工程學(xué)整合起來(lái)［8］。生物反應(yīng)器可以精確及可重復(fù)地控制細(xì)胞培養(yǎng)的很多因素。這些因素包括溫度、pH、培養(yǎng)液流動(dòng)速率、氧氣、營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)及代謝產(chǎn)物的移除。此外，在復(fù)雜三維系統(tǒng)得到研發(fā)過(guò)程中，如何控制種子細(xì)胞植入支架亦得到同時(shí)研究。這方面主要是應(yīng)用外界因素促進(jìn)種子細(xì)胞分化及成熟。目前很多先進(jìn)的系統(tǒng)具有在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中維持和監(jiān)控環(huán)境的能力。有數(shù)種生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)，但是總體來(lái)說(shuō)，可以分為以下幾種:旋轉(zhuǎn)壁式(rotating wall vessels，RWV)、直接灌注系統(tǒng)(direct perfusion system)、中空纖維(hollow fibres)、懸浮培養(yǎng)瓶(spinner flasks)、機(jī)械動(dòng)力系統(tǒng)(mechanical force systems)等。

1.4 三維培養(yǎng)模型的細(xì)胞來(lái)源 三維培養(yǎng)及組織工程所需的細(xì)胞來(lái)源通常來(lái)自于宿主或者供體。由于無(wú)論是從細(xì)胞的來(lái)源或部位來(lái)看，細(xì)胞的種類繁多，但是對(duì)于組織工程而言，通常分為干細(xì)胞、自體細(xì)胞、同種細(xì)胞及異種細(xì)胞等。對(duì)于體外三維培養(yǎng)模型，種子細(xì)胞可以是動(dòng)物來(lái)源的原代細(xì)胞、細(xì)胞系以及以上所有類型細(xì)胞經(jīng)遺傳改良后所有的變種細(xì)胞。許多研究者喜歡采用自體細(xì)胞應(yīng)用于臨床植入，因?yàn)榭梢员苊饷庖吲懦夥磻?yīng)。組織工程軟骨作為典型例子已經(jīng)被廣泛報(bào)道。然而，自體細(xì)胞并不是總是可用的，因?yàn)樵隗w外卻沒(méi)有活力或者無(wú)增殖能力。因此，有時(shí)候只能應(yīng)用同種細(xì)胞，然而，這樣的情況還是會(huì)存在免疫不相容性。異種細(xì)胞在臨床上可以應(yīng)用于在組織內(nèi)提供化學(xué)物質(zhì)。一個(gè)較好的異種移植例子是利用胰島產(chǎn)生胰島素。而這種情況需要一個(gè)半透膜將這些異種胰島細(xì)胞包繞。選用原代細(xì)胞的常見(jiàn)的問(wèn)題是他們獲取困難，或者不能產(chǎn)生足夠的細(xì)胞量來(lái)應(yīng)用于臨床。因此，應(yīng)用前體細(xì)胞和多能干細(xì)胞具有廣闊的前景。對(duì)于前體細(xì)胞的應(yīng)用而言，目前已經(jīng)取得了令人矚目的進(jìn)步:分離、擴(kuò)增、鑒定、定向分化等。造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等來(lái)源的組織有:肺、肝、視網(wǎng)膜、胰腺、心血管系統(tǒng)、腦、脊柱、脂肪組織及骨髓。無(wú)論來(lái)自何組織，任何干細(xì)胞應(yīng)用的最大挑戰(zhàn)在于如何使干細(xì)胞在直接細(xì)胞分化過(guò)程中更高度精準(zhǔn)地向預(yù)期表型分化。

2 角膜三維培養(yǎng)與組織工程學(xué)研究進(jìn)展

2.1 角膜組織工程學(xué)在角膜病治療中的意義 角膜病是僅次于白內(nèi)障的第二大致盲性眼病。目前，世界上有超過(guò)1 000萬(wàn)的雙眼角膜盲患者，而且每年新增角膜盲病例150～200萬(wàn)［9］。角膜移植是目前治療角膜盲的唯一有效治療方法。但角膜移植存在角膜供體嚴(yán)重缺乏、術(shù)后發(fā)生免疫排斥反應(yīng)等問(wèn)題［10］。組織工程角膜(Bioengineered Cornea)的構(gòu)建旨在用其修復(fù)病損的角膜組織，改善患眼視覺(jué)，從而解決角膜供體材料缺乏這一關(guān)鍵問(wèn)題。

角膜由上皮層、前彈力層、基質(zhì)層、后彈力層和內(nèi)皮細(xì)胞層組成。角膜組織中含有角膜上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞三種細(xì)胞，而前彈力層和后彈力層不含細(xì)胞成分。角膜組織工程學(xué)研究構(gòu)建的組織包括上皮、基質(zhì)和內(nèi)皮以及三維角膜。組織工程化角膜上皮應(yīng)用于臨床已有報(bào)道［11，12］。目前，應(yīng)用溫度敏感培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)在體外構(gòu)建出組織工程化角膜內(nèi)皮細(xì)胞片，且已證明這樣的內(nèi)皮細(xì)胞片在細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞間連接及單層細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面和天然的角膜內(nèi)皮細(xì)胞層相似［13，14］。無(wú)論是在進(jìn)行角膜上皮層或角膜內(nèi)皮層重建的過(guò)程中，都必須為之提供理想的載體。而角膜基質(zhì)是所有載體中的最佳選擇。由于角膜基質(zhì)占整個(gè)角膜厚度的90%，基質(zhì)層受損之后由瘢痕組織修復(fù)，使角膜失去透明性。因此，構(gòu)建組織工程角膜基質(zhì)不僅為組織工程角膜上皮或內(nèi)皮細(xì)胞層提供載體，同時(shí)也為修復(fù)受損的基質(zhì)提供手段。

2.2 角膜基質(zhì)組織工程國(guó)內(nèi)外研究概況及研究趨勢(shì) 以種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程角膜基質(zhì)，目前有依賴細(xì)胞本身進(jìn)行自主裝備途徑(Cell-Based Approaches)和依靠支架培養(yǎng)途徑(Scaffold-Based Approaches)。前者主要是依靠培養(yǎng)液中的成分刺激種子細(xì)胞分泌膠原及其他細(xì)胞外基質(zhì)［15～17］，而種子細(xì)胞表達(dá)角膜組織特異性的標(biāo)志物。該方法最大的缺陷是需要較長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)培養(yǎng)可供移植用的角膜基質(zhì)材料。Guo等［16］利用角膜纖維細(xì)胞自主裝備細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix，ECM)，產(chǎn)生多層細(xì)胞而厚度達(dá)36 μm的結(jié)構(gòu)需要4周的培養(yǎng)。

在應(yīng)用種子細(xì)胞和生物學(xué)支架構(gòu)建角膜基質(zhì)的研究領(lǐng)域中，研究者們對(duì)種子細(xì)胞和生物支架都進(jìn)行了廣泛的探索。

2.2.1 種子細(xì)胞 組織工程角膜基質(zhì)中大多數(shù)是利用角膜基質(zhì)細(xì)胞(keratocyte)作為種子細(xì)胞。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用的基質(zhì)細(xì)胞大多來(lái)源于動(dòng)物［18～20］，制備的組織工程角膜基質(zhì)可以用作角膜損傷修復(fù)的體外模型，如以臨床應(yīng)用為目的則需解決異種移植中免疫排斥這一關(guān)鍵性問(wèn)題。此外，基質(zhì)細(xì)胞作為種子細(xì)胞存在的問(wèn)題還有:①如何維持基質(zhì)細(xì)胞在三維培養(yǎng)中的細(xì)胞表型?體外培養(yǎng)會(huì)影響基質(zhì)細(xì)胞的表型。基質(zhì)細(xì)胞在含有血清的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志消失［21，22］。而成纖維細(xì)胞目前被認(rèn)為是促進(jìn)角膜傷口愈合，導(dǎo)致角膜瘢痕化的原因?；|(zhì)細(xì)胞只有在靜止?fàn)顟B(tài)下才可以維持其細(xì)胞表型。然而靜止?fàn)顟B(tài)下即意味著基質(zhì)細(xì)胞無(wú)法大量擴(kuò)增，提示著在合成細(xì)胞與支架復(fù)合體的初始階段就需要大量的基質(zhì)細(xì)胞。②如何獲得大量的人基質(zhì)細(xì)胞用以構(gòu)建組織工程角膜基質(zhì)?人角膜基質(zhì)干細(xì)胞(Human Cornea Stroma Stem Cells)的發(fā)現(xiàn)使這一問(wèn)題的解決成為可能［17，23，24］。人角膜基質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建組織工程角膜基質(zhì)仍存在同種異體移植發(fā)生免疫排斥的可能，而角膜基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)亦受到供體角膜匱乏的局限。

由于角膜組織細(xì)胞來(lái)源有限，應(yīng)用干細(xì)胞和成體細(xì)胞進(jìn)行角膜組織工程學(xué)的研究成為目前的研究熱點(diǎn)。應(yīng)用胚胎干細(xì)胞存在倫理學(xué)問(wèn)題和大量擴(kuò)增可能致瘤的安全性問(wèn)題，使得成體干細(xì)胞受到研究者的青睞［25］。我國(guó)上海交通大學(xué)第九人民醫(yī)院研究組以新生兔皮膚成纖維細(xì)胞為種子細(xì)胞，接種于聚羥基乙酸，體外培養(yǎng)一周后移植入成年兔角膜基質(zhì)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的細(xì)胞可以存活并表達(dá)角膜基質(zhì)特有的基因。這一發(fā)現(xiàn)提示著非眼部細(xì)胞將有可能成為組織工程角膜基質(zhì)的種子細(xì)胞［26］。

2.2.2 支架材料 制備良好的組織工程角膜支架一直是該領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。理想的支架材料應(yīng)具備良好的生物相容性、具有一定的韌性和人體角膜相似的物理化學(xué)性能、降解速率與植入種子細(xì)胞所形成組織器官的速率匹配，在支架完成為角膜組織提供模板功能后，可被完全降解吸收或成為與新生組織相互融合的組成部分等特點(diǎn)［27］。常見(jiàn)的支架材料有膠原、殼聚糖、纖維蛋白、聚羥基乙酸(polyglycolic acid，PGA)、聚乳酸(polylactic acid，PLA)和脫細(xì)胞組織基質(zhì)(acellular corneal matrix)。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用這些支架材料在研制組織工程角膜基質(zhì)上已經(jīng)取得很大的進(jìn)展［28～30］，但是各種支架材料均存在一定局限性。膠原纖維是角膜基質(zhì)的主要組成成分，膠原蛋白占角膜干重的75%。膠原組織相容性好，含有某些特異的氨基酸序列，利于種子細(xì)胞黏附生長(zhǎng)。其不足之處在于穩(wěn)定性較差，機(jī)械強(qiáng)度小，降解快?？梢酝ㄟ^(guò)物理或者化學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行交聯(lián)，提高其機(jī)械強(qiáng)度和抗降解能力。殼聚糖的缺陷是材料與宿主的整合性差。PGA降解過(guò)快，PLA降解產(chǎn)物會(huì)對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生不利影響，引起無(wú)菌性炎癥反應(yīng)。脫細(xì)胞角膜基質(zhì)具有天然角膜的板層纖維結(jié)構(gòu)、韌性及厚度，由于去除了角膜內(nèi)大量的抗原，其免疫原性大為降低，一般采用豬角膜基質(zhì)制備［25］。脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的安全性、組織的透明性等仍需要長(zhǎng)期的評(píng)估。

3 問(wèn)題與展望

尋找理想的種子細(xì)胞和理想的支架材料一直是角膜基質(zhì)組織工程學(xué)領(lǐng)域的“瓶頸問(wèn)題”。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展完善，將分子生物學(xué)、生物化學(xué)等學(xué)科與組織工程學(xué)相結(jié)合是組織工程角膜的研究趨勢(shì)。2009年，角膜組織工程學(xué)界著名的Griffith教授針對(duì)現(xiàn)有研究的局限性，對(duì)角膜組織工程學(xué)界提出:拓展組織工程角膜的種子細(xì)胞來(lái)源，改進(jìn)支架材料，構(gòu)建出含有和人體角膜一樣的生物化學(xué)、形態(tài)、生理甚至遺傳物質(zhì)的理想組織工程角膜，是目前該研究領(lǐng)域的研究目標(biāo)［9］。這一目標(biāo)在既往尋找種子細(xì)胞和改進(jìn)支架材料等研究熱點(diǎn)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提出了重視對(duì)組織工程角膜細(xì)胞生物學(xué)行為、分子機(jī)制、微環(huán)境調(diào)控以及長(zhǎng)期轉(zhuǎn)歸等問(wèn)題進(jìn)行深入研究的要求。相信在不久的將來(lái)，這一目標(biāo)將得以實(shí)現(xiàn)。

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