朱宏斌，楊云生，郭明洲

中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院消化科，北京 100853

腫瘤細(xì)胞周?chē)奈h(huán)境對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移起著非常重要的作用。腫瘤微環(huán)境主要包括細(xì)胞和非細(xì)胞兩大類(lèi)成分，在肝癌組織中前者主要包括肝星狀細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等;后者則主要是上述細(xì)胞釋放到腫瘤間質(zhì)中的各種因子，包括胞外基質(zhì)蛋白、蛋白水解酶、生長(zhǎng)因子和各種炎癥因子。這些非細(xì)胞成分通過(guò)影響腫瘤信號(hào)通路調(diào)節(jié)腫瘤的各種生物學(xué)行為。其中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β，TGF-β)對(duì)肝癌的發(fā)生起著雙向調(diào)節(jié)的作用，是目前研究的一大熱點(diǎn)，本文就該方面的研究進(jìn)展作一概述。

1 TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β(transforming growth factor β，TGF-β)是一個(gè)龐大的家族，脊椎動(dòng)物TGF-β超家族包括 TGF-β、激活素(activins)、抑制素(inhibins)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)。哺乳動(dòng)物 TGF-β 共有三種:TGF-β1、TGF-β2 和 TGF-β3，研究發(fā)現(xiàn)，三種亞型由不同的基因編碼，雖然具有相似的生物活性但其基因的表達(dá)具有明顯的組織及發(fā)育特異性，其中肝臟含量最高且具有生物活性的TGF-β1。TGF-β1作用復(fù)雜，廣泛參與哺乳動(dòng)物的各種病理生理過(guò)程，影響細(xì)胞的增殖分化，在創(chuàng)傷愈合、胚胎發(fā)育、細(xì)胞外基質(zhì)的形成、骨改建、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等過(guò)程中發(fā)揮作用。

TGF-β1在腫瘤中主要參與刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和分化，抑制天然免疫以及基質(zhì)代謝的精細(xì)調(diào)節(jié)等活動(dòng)。TGF-β可以通過(guò)Smad依賴(lài)通路和非Smad依賴(lài)通路發(fā)揮作用。TGF-β1信號(hào)通過(guò)激活受體TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，使受體激活Smad(R-Smad)磷酸化，R-Smad與共同型Smad(Co-Smad)形成復(fù)合體，信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)。細(xì)胞核內(nèi)Smads寡聚體結(jié)合DNA和相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控靶基因的表達(dá)。R-Smad和Co-Smad可以在胞漿和細(xì)胞核間穿梭。抑制型Smad(I-Smad)可阻斷受體磷酸化R-Smad，啟動(dòng)泛素化作用，受體復(fù)合物降解，這樣抑制了信號(hào)的傳導(dǎo)。STRAP可以穩(wěn)定TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ與I-Smad形成的復(fù)合體，EGF受體和其他酪氨酸激酶受體的活化都可以誘導(dǎo)I-Smad的表達(dá)，抑制TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。普遍認(rèn)為該通路的激活與TGF-β發(fā)揮腫瘤抑制作用有關(guān)。此外，還有非Smad依賴(lài)通路，盡管其機(jī)制尚不明確，但一般認(rèn)為這些通路的激活單獨(dú)或者聯(lián)合Smad依賴(lài)通路腫瘤抑制作用的缺失可以發(fā)揮促進(jìn)腫瘤發(fā)展的作用。活化的受體復(fù)合物形成后，可以激活 PI3K/Akt、Rho/Rac GTPases、Ras/MAPK 和TAK1/MEKK1等非Smad依賴(lài)通路。TAK1(TGF-β激活的激酶1)可以介導(dǎo)TGF-β激活不同的MAP激酶通路，如JNK、P38等。TGF-β也可以誘導(dǎo)Cdc42 GTPase以及PP2A的活化而發(fā)揮非Smad依賴(lài)通路的生長(zhǎng)抑制作用［1-2］。

2 TGF-β與肝細(xì)胞肝癌(HCC)的關(guān)系

2.1 TGF-β在肝臟炎癥及纖維化中的作用 慢性肝炎及相關(guān)的肝纖維化和肝硬化是肝細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的主要因素，并且涉及到肝臟中所有種類(lèi)的細(xì)胞。就肝癌發(fā)生的病理生理學(xué)而言，腫瘤微環(huán)境釋放的因子產(chǎn)生持續(xù)、失衡的生長(zhǎng)刺激，有利于惡性細(xì)胞和癌前細(xì)胞的選擇性生長(zhǎng)。最初，發(fā)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞在各種因子的作用下逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，之后局部血管生成可以形成特定的微環(huán)境為腫瘤生長(zhǎng)提供足夠的營(yíng)養(yǎng)，免疫細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞合成并分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶降解脈管基底膜則利于腫瘤細(xì)胞跨越屏障。肝臟中各種細(xì)胞被激活后才能募集炎癥相關(guān)的免疫細(xì)胞，而各種生長(zhǎng)因子和促炎介質(zhì)促進(jìn)了肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能損害。普遍認(rèn)為T(mén)GF-β1是肝臟中一個(gè)重要的促纖維化因子，參與了肝臟纖維化的所有關(guān)鍵步驟［3］。在正常人的肝臟中無(wú)TGF-β1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，而在部分肝切除后，肝組織的各種細(xì)胞均可檢測(cè)到 TGF-β的轉(zhuǎn)錄［4］。在膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的肝損傷模型中，只在肝星狀細(xì)胞中檢測(cè)到了TGF-β的表達(dá)［4］。在纖維化結(jié)節(jié)沿著纖維化隔膜的基質(zhì)中，檢測(cè)到了TGF-β1的表達(dá)，而從正常到發(fā)生硬化的肝組織都不表達(dá)TGF-β1，同時(shí)腫瘤結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)大量的TGF-β1［5］。胞外基質(zhì)中的TGF-β1是以無(wú)活性的latent形式存在，可以被腫瘤微環(huán)境中富含的MMP-2、MMP-9激活，并結(jié)合于TGF-βRⅡ啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。TGF-β的表達(dá)在纖維化的肝臟中顯著上升，可能誘導(dǎo)星狀細(xì)胞的增殖和膠原的產(chǎn)生，它誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞(HSC)的增殖需要激活JNK通路，研究表明JNK通路的廣泛抑制劑可以抑制PDGF、TGF-β和血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化，并減弱PDGF和TGF-β信號(hào)通路的活性［6］。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)可以介導(dǎo)TGF-β的活化，參與HSC介導(dǎo)的肝臟纖維化［7］。更重要的是，近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)TGF-β導(dǎo)致的纖維化作用因病因而異，說(shuō)明TGF-β在不同的慢性肝臟疾病中不是一個(gè)通用的促纖維化因子，對(duì)臨床標(biāo)本的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TGF-β主要參與HBV感染相關(guān)的肝纖維化，而HCV感染相關(guān)的肝纖維化主要與IL-13有關(guān)，并在某些病例中，還有其他的因子參與該過(guò)程［8］，為抗纖維化治療提出了新的問(wèn)題。

2.2 TGF-β在HCC中的作用及其調(diào)控 TGF-β在正常細(xì)胞癌變初期可作為抑癌因子抑制細(xì)胞增殖、啟動(dòng)細(xì)胞分化或凋亡，而在腫瘤晚期失去對(duì)某些癌細(xì)胞的抗增殖作用，而刺激血管生成、抑制免疫反應(yīng)、促進(jìn)ECM(extra cellular matrix)形成，為腫瘤細(xì)胞的快速生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移提供良好的局部環(huán)境，成為促進(jìn)因子［9］。其作用在不同的組織中，不同的環(huán)境下截然不同，腫瘤細(xì)胞主要通過(guò)兩種方式逃避TGF-β的腫瘤抑制作用，一是滅活該通路上的關(guān)鍵分子，如受體、R-Smad、Co-Smad，影響整個(gè)通路的活性，已經(jīng)在結(jié)腸和胰腺腫瘤中發(fā)現(xiàn)了 TGF-β RⅠ、TGF-βRⅡ、Smad2、Smad4 的突變;二是某些腫瘤只對(duì)TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞抗增殖作用選擇性地逃避，而保留TGF-β的促進(jìn)分裂、侵襲、轉(zhuǎn)移等功能，如高表達(dá)Myc蛋白，Akt或Ras/MAPK通路活性的異常增高，以及穩(wěn)定TGIF分子，促進(jìn)FoxG1、Ski/SnoN、Evi-1 的表達(dá)，高表達(dá) Smad7 等抑制因子［10］，而高水平的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)也能阻止TGF-β的增殖抑制作用［11］。上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是多細(xì)胞生物胚胎發(fā)生發(fā)育過(guò)程中的基礎(chǔ)過(guò)程，也存在于多種慢性疾病(如腎纖維化)及腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程中。上皮細(xì)胞具有極性并通過(guò)細(xì)胞間的橋連而緊密相連，從而防止細(xì)胞的遷移。相反，間質(zhì)細(xì)胞間沒(méi)有穩(wěn)定的連接，且具有收縮和運(yùn)動(dòng)的能力。在EMT的過(guò)程中，上皮細(xì)胞失去彼此間的連接，同周?chē)?xì)胞分離并獲得間質(zhì)細(xì)胞樣特征，從原發(fā)部位游離。EMT的發(fā)生涉及多個(gè)環(huán)節(jié)，包括(1)啟動(dòng)因子(如TGF-β、HGF等);(2)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;(3)轉(zhuǎn)錄因子(Twist、snail、ZEB、Wnt)等。TGF-β 可以刺激從上皮細(xì)胞和間充質(zhì)前體細(xì)胞中產(chǎn)生具有高度運(yùn)動(dòng)能力的肌成纖維細(xì)胞，后者存在于腫瘤基質(zhì)中，可以促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、腫瘤的侵襲和形成新生血管［12-13］。此外，TGF-β與腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，這種作用在不同腫瘤及腫瘤發(fā)展的不同階段有明顯的差異。在腫瘤晚期，如 TGF-β 促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移［14］、TGF-β/Smad 通路介導(dǎo)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移等［15］，而在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型中，穩(wěn)定表達(dá)TGF-β抑制因子Smad7也可以促進(jìn)肝臟轉(zhuǎn)移灶的形成［16］。

與胰腺癌和結(jié)腸癌不同，HCC很少發(fā)生TGF-β受體和Smad蛋白的滅活性突變，而且HCC細(xì)胞高表達(dá)并且分泌 TGF-β［17］，這些都提示在HCC中肝細(xì)胞有完整的TGF-β通路，通過(guò)改變下游分子而使TGF-β通路僅僅失去細(xì)胞增殖抑制作用［18］。HBx蛋白激活Ras/絲裂原活化的蛋白激酶途徑，包括胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶和JNK導(dǎo)致細(xì)胞增殖，TGF-β可以激活TGF-βRⅠ和c-Jun N端激酶(JNK)，它們分別通過(guò)磷酸化Smad3 C-末端區(qū)域(pSmad3C)和中間linker(pSmad3L)而傳遞信號(hào)，表達(dá)HBx的肝細(xì)胞可以在腫瘤抑制和腫瘤形成間進(jìn)行可逆性轉(zhuǎn)變，提示 Smad3的 C-端區(qū)域(pSmad3C)磷酸化傳輸一種腫瘤抑制TGF-β信號(hào)，而Smad3鏈接器區(qū)域(pSmad3L)磷酸化促進(jìn)了肝臟的纖維化及癌細(xì)胞的侵襲性，并且能抑制Smad3C的磷酸化［19-20］。對(duì)臨床標(biāo)本的檢測(cè)進(jìn)一步表明，在腫瘤發(fā)生的早期，HBx蛋白將肝細(xì)胞的TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上抑制性通路轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)腫瘤有促進(jìn)作用的通路，并認(rèn)為評(píng)估HBV感染的標(biāo)本中的pSmad3C和pSmad3L有助于評(píng)價(jià)HCC發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)［21］。Matsuzaki等通過(guò)對(duì)有HCV感染史的肝炎、肝硬化、肝癌患者進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)論，他們發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞中pSmad3L/PAI-1的增加伴隨著肝纖維化和壞死性炎癥的發(fā)展以及pSmad3C/p21(WAF1)的減少，這一過(guò)程與肝癌的發(fā)生明顯相關(guān)，而IL-1β激活JNK通路參與了這種轉(zhuǎn)換，從而認(rèn)為HCV感染導(dǎo)致慢性炎癥能使肝細(xì)胞中TGF-β的腫瘤抑制作用轉(zhuǎn)變?yōu)榇倮w維化作用，增加HCC發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)［22］。另有文獻(xiàn)報(bào)道，tristetrapolin啟動(dòng)子區(qū)特定位點(diǎn)的甲基化，影響了它對(duì)c-myc的轉(zhuǎn)錄后修飾，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞中c-myc水平的異常增高，TGF-β不能產(chǎn)生腫瘤抑制作用而成為促進(jìn)腫瘤形成的因素［23］。其他腫瘤存在類(lèi)似的現(xiàn)象，如 disabled homolog 2(DAB2)在頭頸部鱗癌細(xì)胞中以及PDGF-B在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)變化均能影響這些細(xì)胞對(duì)TGF-β腫瘤抑制作用的敏感性［24-25］。上述研究表明肝癌細(xì)胞以不依賴(lài)于滅活TGF-β/Smad通路關(guān)鍵分子的方式選擇性地耐受TGF-β的抗細(xì)胞增殖作用。

TGF-β能夠促進(jìn)HCC細(xì)胞發(fā)生EMT，Giannelli等報(bào)道肝癌組織中胞外基質(zhì)蛋白Laminin-5、Snail和Slug的表達(dá)明顯高于癌旁組織，E-cadherin的表達(dá)低于癌旁組織，發(fā)生EMT的肝癌細(xì)胞E-cadherin的表達(dá)下降。當(dāng)Laminin-5單獨(dú)作用于肝癌細(xì)胞時(shí)，后者表現(xiàn)出部分EMT的特征，而與TGF-β的共同作用使肝癌細(xì)胞發(fā)生完全EMT，認(rèn)為微環(huán)境中細(xì)胞因子的變化可以成為腫瘤生物治療的靶點(diǎn)［26］。TGF-β也能誘導(dǎo)胎肝細(xì)胞發(fā)生EMT，此時(shí)，細(xì)胞高表達(dá)Snail、E-cadherin表達(dá)下降，細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)蛋白并發(fā)生肌動(dòng)蛋白骨架重排［27］。TGF-β調(diào)控著HCC細(xì)胞與腫瘤基質(zhì)間的交互作用，將肌成纖維細(xì)胞與惡性轉(zhuǎn)化的肝細(xì)胞共同移植小鼠明顯促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，干擾PDGF通路后，E-cadherin和beta-catenin的表達(dá)及分布都無(wú)變化，從而阻斷了HCC 細(xì)胞發(fā)生 EMT［28］。

3 以TGF-β為基礎(chǔ)的肝癌診斷和靶向治療

HCC患者血液及尿液中TGF-β的濃度較健康人群明顯上升，并與 HCC的惡性程度和預(yù)后明顯相關(guān)［29-30］。多數(shù)研究結(jié)果都認(rèn)為在 HCC患者中分析TGF-β水平是可行的，并且有助于預(yù)后分析。為了提高TGF-β在預(yù)后分析中的價(jià)值，可以聯(lián)合應(yīng)用其他蛋白標(biāo)志，如與 AFP聯(lián)合以提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性［31］。Okumoto等研究發(fā)現(xiàn)HCC患者血漿中TGF-β濃度大于10 ng/mL者預(yù)后較差，反之則預(yù)后較好［32］，Dong等則發(fā)現(xiàn)肝臟TGF-β1的表達(dá)與HCC的分化程度和HBV的復(fù)制狀態(tài)有關(guān)，HCC組血清中TGF-β1及TGF-β1 mRNA的水平明顯升高，并且TGF-β1達(dá)到1200 ng/mL時(shí)，對(duì)HCC診斷的敏感性和特異性分別達(dá)到89.5%和 94%，與 AFP聯(lián)合應(yīng)用，其檢出率可達(dá)97.4%，對(duì)于HBV相關(guān)HCC的診斷和治療有重要意義［30］。但這種檢測(cè)仍有不足之處，重要的一點(diǎn)是得到的數(shù)值不穩(wěn)定，一方面是由于疾病本身的異質(zhì)性，另一方面在樣品的回收和檢測(cè)中難免混雜血小板來(lái)源的TGF-β［29-33］。

肝癌的治療方案以手術(shù)切除為首選，對(duì)于不能切除的肝癌，有些需要進(jìn)行系統(tǒng)治療，但是可以選擇的藥物較少，典型藥物是多靶點(diǎn)抑制劑索拉非尼，其抗血管生成作用是目前改善HCC患者生存率的主要途徑，許多新靶向藥物都是血管生成抑制劑。肝臟的纖維化是肝細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的一個(gè)階段，但是針對(duì)纖維化及延緩HCC發(fā)生的藥物卻很少，鑒于TGF-β在肝臟纖維化中的重要作用，其抑制劑可能成為HCC治療的新途徑。目前，這類(lèi)靶向藥物主要包括特異性的抑制劑和非特異性的抑制劑。非特異性的抑制劑有halofuginone、trichostatin、lenalidomide 以及其他的組蛋白去乙?；敢种苿?，他們可以抑制包括TGF-β在內(nèi)的多條信號(hào)通路。特異性的TGF-β抑制劑主要通過(guò)3種方式發(fā)揮作用:①用反義寡核苷酸(ASO)在蛋白翻譯水平抑制，如AP-12009;②用單克隆抗體抑制配體/受體的結(jié)合，如 Lerdelimumab(CAT-152);③ 用 TGF-β 受體激酶抑制劑作用于受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，如LY-573636已進(jìn)入Ⅱ期臨床［1］。已有30多種特異性靶向藥物進(jìn)入臨床研究［34］，但在肝癌中的研究較少。

HCC是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，絕大多數(shù)HCC都有肝硬化基礎(chǔ)，確診時(shí)已多屬中、晚期，缺乏有效治療，預(yù)后差。雖HCC非手術(shù)療法有所進(jìn)展，但手術(shù)切除仍是目前最有效的治療方法。晚期HCC切除后復(fù)發(fā)率高，易轉(zhuǎn)移，早期診斷與靶向治療極為重要。TGF-β在胚胎發(fā)生發(fā)展、肝細(xì)胞生長(zhǎng)和分化過(guò)程中起重要作用，與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，TGF-β在癌變?cè)缙谄鹨种谱饔?，進(jìn)展期則失去這種作用，對(duì)其機(jī)制的深入研究可能為HCC早期診斷、療效及預(yù)后判斷提供新的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

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