李井春，李雁冰，張乃博，劉勝軍，曲永利，賀顯晶，孫蕊，舟橋弘晃

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院動物繁殖實驗室，大慶163319；2.山東大學生命科學學院；3.日本岡山大學自然科學研究科）

人工授精技術(shù)是目前家畜改良的重要技術(shù)手段之一。通常，如豬每次人工授精輸入1～5億個精子，最終只有幾百個精子能夠到達受精部位[1]。然而，注入的大部分精子從母畜生殖道通過回流和被子宮內(nèi)的白血球所吞噬而損失。如果這些損失可以通過某種方法去控制，我們將可以減少人工授精時精子數(shù)量來提高改良的效率。目前，關(guān)于影響家畜人工授精誘導子宮炎癥反應(yīng)因素的論文還未見報道，主要從動物繁殖免疫學的角度分析，母畜生殖道人工授精前后的免疫細胞的分布情況、精子在子宮內(nèi)損失的原因、人工授精精液稀釋液成分對子宮免疫反應(yīng)的影響以及控制由人工授精誘導的子宮免疫反應(yīng)的措施等方面做一系統(tǒng)的綜述。

1 母畜生殖道內(nèi)免疫細胞隨發(fā)情周期的變化的分布情況

1.1 未配種母畜在發(fā)情周期的不同階段子宮內(nèi)膜中白細胞的形態(tài)和分布

母畜生殖道的子宮內(nèi)膜隨性腺激素水平的變化而做相應(yīng)變化。有研究已經(jīng)證實隨著這些激素的改變，雌性生殖道上皮形態(tài)和白細胞的分布也發(fā)生變化[2-3]。子宮上皮是由表面上皮細胞和腺上皮細胞組成。間情期時在孕激素的影響下，表面上皮細胞是呈立方型和低柱狀[4]。在間情期中期，腺上皮細胞分泌活動達到高峰。向發(fā)情期過渡時，以雌激素為主，目前有研究表明主要是子宮重量和子宮內(nèi)膜厚度增加[5]。以上變化主要是為滿足交配要求子宮而作的準備。

1.2 母畜生殖道內(nèi)免疫細胞類型和分布

在子宮內(nèi)膜中發(fā)現(xiàn)的免疫細胞的類型主要包括淋巴細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞（polymorphonuclear leucocytes，PMNs）、嗜酸性粒細胞等[3]。大多數(shù)細胞在任何時間都能夠發(fā)現(xiàn)，但它們的數(shù)量隨發(fā)情周期不同而發(fā)生變化[6]。

在母畜生殖道內(nèi)，參加自然免疫反應(yīng)的白細胞主要有嗜中性粒細胞和巨噬細胞兩種，主要聚集在子宮內(nèi)膜和子宮頸基質(zhì)膜中，在發(fā)情前期，它們會穿過子宮內(nèi)膜進入到子宮腔或子宮頸腔[7]。發(fā)情期時，如母羊生殖道內(nèi)的嗜中性粒細胞和巨噬細胞顯著增加，其中嗜中性粒細胞在發(fā)情后24 h時達到峰值，巨噬細胞在18 h到達峰值，隨后開始下降到發(fā)情前期的水平；此外，母牛的生殖道內(nèi)的白細胞大約95%是嗜中性粒細胞，并且在子宮頸和子宮內(nèi)膜基質(zhì)中的分布與交配后的母牛相似[8]。

母畜生殖道內(nèi)的白細胞的類型和分布主要受激素水平的影響。在發(fā)情前期大量的白細胞分布在內(nèi)膜基質(zhì)中，當進入發(fā)情期或有交配行為時，白細胞迅速地遷移到子宮頸或子宮腔內(nèi)，參與子宮的免疫反應(yīng)。一些研究者證實自然交配或人工授精都可以誘導子宮短暫的炎癥反應(yīng)。對于配種后炎癥反應(yīng)，主要由嗜中性粒細胞參與完成[9-10]。

2 人工授精的精液稀釋液成分對子宮炎癥反應(yīng)的影響

人們研究發(fā)現(xiàn)自然交配或人工授精后，大量的嗜中性粒細胞迅速遷移到子宮腔[9]。如人工授精后母豬生殖道內(nèi)的精子數(shù)量在數(shù)小時內(nèi)下降到輸入精子總數(shù)的5%～10%[11]。但是，免疫細胞趨化和吞噬精子可考慮作為正常生理反應(yīng)，可能為胚胎在子宮內(nèi)著床做必要的準備。然而，目前還不清楚是什么原因引起的白細胞遷入到子宮腔內(nèi)，以及來如何控制嗜中性粒細胞的趨化和吞噬作用。此外，精液成分對子宮免疫狀態(tài)和妊娠的建立的影響也不清楚。

2.1 精漿對PMNs的趨化性和吞噬性的影響

有研究表明家畜的精漿可以調(diào)節(jié)PMNs的趨化和對精子的吞噬活性[12]。有研究顯示精子可能通過某些成分誘導PMNs的趨化。例如使用稀釋的精液進行人工受精后，子宮腔內(nèi)的PMNs顯著增加，但當0.1%精漿存在時，子宮腔內(nèi)的PMNs數(shù)量明顯減少[13]。然而，也有報道稱配種后豬精漿誘導子宮的炎癥反應(yīng)[24]。Alghamdi等人實驗結(jié)果表明馬的精漿能夠顯著減少PMNs對精子的吞噬作用[14]。此外，來源于馬精漿蛋白也明顯抑制PMNs對精子的吞噬，體外實驗結(jié)果顯示馬的精漿同樣明顯抑制PMNs的趨化性、吞噬性和補體的活性[9]。

有研究證實了精漿能夠抑制PMNs對精子的趨化和吞噬活性，從而使子宮腔內(nèi)的具有活力的精子數(shù)增加。李井春等人的體外實驗結(jié)果表明家畜精漿能夠抑制PMNs對精子的趨化和吞噬活性[15-16]。

2.2 精液稀釋液成分（卵黃）對PMNs的趨化性和吞噬性的影響

有研究報道稱母豬子宮內(nèi)的PMNs是由于人工授精時輸入一定體積的液體量、而不是由于液體中的某些成分或精漿觸發(fā)PMNs向子宮腔劇增[9]。然而，人工授精12 h后，還有大量的PMNs存在于子宮腔內(nèi)，主要可能原因與精子的存在有關(guān)[10]。Matthijs等人的研究結(jié)果證實損傷、死的或過獲能精子并沒有完全被吞噬掉，但是精子獲能處理能夠明顯降低精子被吞噬的數(shù)量。

此外，雞的卵黃是一種有效防止精子冷休克和保護精子功能及受精能力的稀釋液和冷凍保護劑。近來，卵黃被證實與牛精漿對PMNs吞噬作用抑制作用相反[17]。此外，在狗的人工授精中，含有卵黃稀釋液的精液人工授精后有可能誘導子宮內(nèi)炎癥反應(yīng)[18]。李井春等研究結(jié)果也證實在體外卵黃增強PMNs的趨化性[19]。

3 精子在子宮內(nèi)的選擇

3.1 精子的損失

豬人工授精后很短一段時間（數(shù)分鐘至數(shù)小時）內(nèi)發(fā)生精液逆流，一次損失的精子數(shù)量達輸入精液的45%左右[10-11]。大量的精子通過陰道逆流而損失主要依賴于人工授精時的精液體積和母豬的狀態(tài)變化而變化。精液逆流被認為是一種正常的生理現(xiàn)象，這種現(xiàn)象存在于每頭母豬，只要輸入的精子數(shù)量不是很低，損失的數(shù)量一般對受胎率有不良的影響。精液逆流現(xiàn)象的存在，它可能是與子宮的大小有關(guān)，有實驗結(jié)果表明初產(chǎn)豬要比經(jīng)產(chǎn)豬的逆流體積要大。

3.2 子宮內(nèi)精子的選擇

大量的研究結(jié)果證實人工授精誘導大量的PMNs遷移到子宮腔，并吞噬精子[9-10，17]。通常，PMNs的吞噬作用去除了子宮內(nèi)輸入的大量過剩精子和細菌，通過這種清除作用，為即將附植的胚胎做好準備[1]。但是，沒有數(shù)據(jù)證明損傷的、老化的及死亡的精子成為PMNs吞噬的對象，李井春等人研究結(jié)果表明在體外實驗中PMNs不管精子的死、活的吞噬率沒有顯著的差異[16]，這種吞噬僅僅對子宮內(nèi)的精子起作用，而在輸卵管中幾乎沒有PMNs的存在。大多數(shù)的研究結(jié)果證實了人工授精后輸入的精子數(shù)量在很短時間內(nèi)迅速減少，起初是通過陰道精液逆流作用起主要作用，隨后PMNs吞噬精子成為精子損失的主要途徑之一。經(jīng)過子宮內(nèi)的選擇，僅有少量的有活力且具有受精能力的精子才能到達輸卵管壺腹部，而且數(shù)量小于102個。

4 控制免疫細胞對精子的趨化和吞噬作用的技術(shù)措施

以上精子損失的原因的分析，通過PMNs吞噬精子方式將精子從子宮內(nèi)清除是一種正常的并且必要的過程。在某種程度上抑制或延遲PMNs的劇增和吞噬精子也成為研究的焦點，以至于使用少量的精子成功地完成受孕的過程。

4.1 改良精液稀釋液

近來，為了使用少量的精子人工授精維持較高的妊娠率，使精子在雌性生殖道內(nèi)損失量達到最小化。盡管PMNs吞噬活性的調(diào)控可能使精子的損失，精漿成分對PMN的吞噬性影響的研究在許多家畜上得到證實，目前根本的機理還不清楚，有待進一步研究。

有研究報道調(diào)節(jié)豬的PMNs吞噬性的研究。新鮮的血漿中含有活性補體成分，可以通過調(diào)理靶細胞來刺激PMNs的活性，盡管血漿也可誘導精子頭與頭的凝集，特別是對于具有完整質(zhì)膜的精子[20]。

用僅含有磷酸二脂酶抑制劑——咖啡因或與鈣離子一起混合的培養(yǎng)液預(yù)處理精子使精子獲能，明顯減少PMNs對精子的吞噬[10]。盡管獲能物質(zhì)，如咖啡因，肝素激活精子并減少精子數(shù)量級數(shù)，它可能增加PMN對精子的吞噬性。在體外吞噬實驗?zāi)Ｊ街蠵MN吞噬活性通過添加咖啡因和氯化鈣被降低[10]。此外，山口等實驗結(jié)果顯示使用添加咖啡因和氯化鈣的豬的冷凍精液人工授精能夠明顯降低PMNs對精子的吞噬率并提高豬的受胎率[23]。李井春等也同樣證明了咖啡因明顯降低PMNs對精子的趨化性和吞噬性[15-16]。

此外，肝素是一種粘多糖，通常作為抗凝血劑而使用以及用于牛的刺激精子獲能[21]。另外，肝素也抑制兔PMNs對細菌的吞噬性。有報道稱在體外實驗中，肝素抑制豬、牛PMNs對精子的趨化性和吞噬性[15]。

4.2 改良人工授精方法：子宮角深部輸精方法

最近幾年，豬的輸精技術(shù)得到發(fā)展和改良[22]。使精子能輸?shù)礁畹牟课弧訉m角。子宮角深部輸精方法已經(jīng)在豬上得到應(yīng)用，這種技術(shù)應(yīng)用低數(shù)量精子進行人工授精，取得與常規(guī)相似的結(jié)果。這種技術(shù)的基礎(chǔ)是以很小的體積將精子放到接近受精的部位，這樣就避免了精子在子宮腔中的運行，這樣就減少了精子在子宮內(nèi)的損失，同時也避免了精液的逆流。

無論在人工授精的精液中添加一些免疫抑制物，還是使用新的人工輸精方法，其主要的目的是減少PMNs向子宮腔內(nèi)的遷移和降低PMNs對精子的吞噬性來提高人工授精的受孕率。

5 展望

配種后子宮炎癥反應(yīng)是一個復(fù)雜的、難懂的過程。人工授精誘導家畜子宮內(nèi)的炎癥反應(yīng)機理以及精子在子宮內(nèi)的損失機制的研究較少，精液中的哪種成分誘導嗜中性粒細胞趨化、PMNs如何吞噬精子以及通過什么方式抑制PMNs的趨化和吞噬作用等問題，仍然是今后研究工作的重要課題。家畜子宮免疫反應(yīng)機理的研究，一方面可以為家畜繁殖免疫學的發(fā)展積累資料，另一方面為家畜人工授精技術(shù)的發(fā)展提供幫助，特別是為低劑量精子人工授精技術(shù)的開發(fā)提供新的途徑。

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