陳 斌

利川市人民醫(yī)院康復(fù)科(湖北 利川 445400)

隨著人類基因組計劃的完成，人類正從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(Structural genomics)進入功能基因(Functional genomics)和功能蛋白質(zhì)組(Functional proteomics)時代[1]，也促進了基因芯片技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)等與中醫(yī)藥研究有關(guān)的高新技術(shù)的發(fā)展。其中，基因芯片技術(shù)以高通量、高集成、多樣化和自動化等特點而被廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥各領(lǐng)域的研究中?，F(xiàn)對基因芯片技術(shù)在中醫(yī)“證侯”、中藥和針刺機制研究中的應(yīng)用取得的一些成果進行綜述。

1 基因芯片技術(shù)

基因芯片(genechip)(又稱DNA芯片、生物芯片)是根據(jù)核酸互補雜交原理而研制出來的[2]。基因芯片的測序原理是雜交測序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進行核酸序列測定的方法，在固相支持物表面固定序列已知的核苷酸的分子探針，組成微陣列，利用核酸雜交原理，然后進行熒光共聚焦檢測，最后通過計算機軟件比較和統(tǒng)計分析后，可對大量基因的表達水平、突變和多態(tài)性進行快速、并行、準(zhǔn)確、高效地檢測分析[3]。且一塊芯片一次雜交可以對成千上萬個基因的表達情況進行分析，形成完整的基因表達譜，目前已成為基因表達分析的最常用的工具[4]。

近年來,基因芯片技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于中醫(yī)藥研究各領(lǐng)域，主要體現(xiàn)在中醫(yī)中證候研究、中藥作用機理研究、中藥有效成分篩選、中藥藥材鑒定及探索針刺作用機制等方面，并取得了一定成果。

2 基因芯片技術(shù)在中醫(yī)“證”研究中的應(yīng)用

辨證論治是中醫(yī)診斷和治療疾病的主要手段之一，辯證是論治的前提，所以證是中醫(yī)學(xué)中的重點、難點和熱點。所謂證是指在疾病發(fā)展過程中，某一階段的病理概括，它包括原因、病的部位、病的性質(zhì)、和邪正關(guān)系，反映了疾病發(fā)展過程中，該階段病理變化的全面情況[5]。但證的本質(zhì)研究一直未取得實質(zhì)性的進展，因為簡單的證，也會影響到人體全身各個系統(tǒng)、組織及細胞，引起非常復(fù)雜的變化。

建立中醫(yī)“證”的基因表達譜，將是21世紀(jì)中醫(yī)藥學(xué)的主要發(fā)展趨勢[6]。利用基因芯片的多態(tài)性表達技術(shù)，對用傳統(tǒng)中醫(yī)方法確診的證進行基因表達譜的建立，推斷表達譜基因的相互關(guān)系，揭示證與基因的實質(zhì)關(guān)系，有可能從分子水平揭示證的本質(zhì)。柴可夫等[7]用基因芯片檢測2型糖尿病中醫(yī)濕熱困脾證的基因表達,通過基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)其和健康人表達差異的基因共38條，其中上調(diào)的基因有24條，下調(diào)的基因有14條。并發(fā)現(xiàn)濕熱困脾證的特異性基因。潘志強等[8]用基因芯片檢測肝癌小鼠早期邪毒壅盛證和氣虛證、中期陽氣虛證、中晚期氣陰陽虛證三個階段4個征候腎上腺素基因表達的差異，結(jié)果篩選到不同階段一致上調(diào)的基因73個，一致下調(diào)的基因26個。吳遠勝等[9]用基因芯片技術(shù)對系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者基因差異表達進行了檢測分析，共發(fā)現(xiàn)了16大類580條基因有顯著差異表達，其中熱毒熾盛型和陰虛內(nèi)熱型大部分基因與代謝相關(guān)的基因表達有一致性。倪紅梅等[10]基因芯片技術(shù)術(shù)篩選，分析青少年腎陽虛體質(zhì)者外周血白細胞的差異表達基因，共篩選出127條符合標(biāo)準(zhǔn)的差異表達基因，其中63條呈上調(diào)表達，64條呈下調(diào)表達。與青少年腎陽虛體質(zhì)相關(guān)的基因表達涉及到免疫相關(guān)、發(fā)育相關(guān)、細胞生長、細胞受體、細胞信號和傳遞蛋白、蛋白翻譯合成等，其中，CCNH基因與PSMB7基因的表達差異最大，提示這兩條基因可能與青少年腎陽虛體質(zhì)密切相關(guān)。這些均說明基因表達差異與證候是有關(guān)聯(lián)的。

3 基因芯片技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用

3.1中藥作用機理研究由于化學(xué)藥品毒副作用的不斷增強，人們把眼光也逐漸轉(zhuǎn)向了天然的中藥藥物治療。因其缺乏科學(xué)的理論支持，中藥復(fù)雜的作用機制至今仍是中藥國際化的瓶頸?；蛐酒夹g(shù)以其高通量、并行、高內(nèi)涵的優(yōu)勢為探索中藥作用機理等現(xiàn)代中藥研究開辟了嶄新的領(lǐng)域[11]。利用基因芯片確定靶組織的基因表達模式，可將中藥作用的所有靶基因全部顯示出來，從而為揭開中藥作用機制提供了有效的依據(jù)。于華蕓等[12]利用基因芯片技術(shù)探討寒性中藥大黃清熱瀉火解毒的作用機制。通過基因表達譜結(jié)果與生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)大黃組與正常對照組比較有398條基因差異表達。并發(fā)現(xiàn)2個顯著性基因功能亞類：防御反應(yīng)，涉及21條差異基因；脂代謝過程，涉及11條差異基因，主要參與花生四烯酸代謝過程。調(diào)控機體防御反應(yīng)、花生四烯酸代謝相關(guān)基因表達，可能是大黃發(fā)揮清熱瀉火解毒作用的分子機制之一。祁冰等[13]應(yīng)用基因芯片技術(shù)分析丹參提取物——隱丹參酮對胰島素抵抗卵巢顆粒細胞基因表達的影響，共篩查出42個差異基因，其中22個基因表達下調(diào)，20個基因表達上調(diào)。研究表明，隱丹參酮可以通過調(diào)節(jié)多個基因、作用多個信號途徑來改善胰島素抵抗卵巢顆粒細胞的狀態(tài)。

3.2中藥有效成分的篩選中藥的有效成分及其作用機制非常復(fù)雜，不管是單方和復(fù)方。由于技術(shù)手段的限制，傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法提取出來的中藥成分的藥理作用不明，而且利用傳統(tǒng)的藥理篩選方法來篩選中藥的有效成分，耗時長、工作量大、效率低，研究經(jīng)費高。如果利用基因芯片的高通量、平行快速檢測的特點來篩選中藥的有效成分，可避免大量動物實驗，縮短藥物篩選所需要的時間和周期，節(jié)約實驗經(jīng)費。利用基因芯片技術(shù)對中藥或者中藥某些成分進行分析，可將中藥的成分與基因表達相關(guān)聯(lián)，通過分析比較不同藥物成分對基因表達譜的 影響，確定發(fā)揮藥效的部分。據(jù)報道，香港科技大學(xué)生物技術(shù)研究所利用基因芯片技術(shù)已經(jīng)篩選到知母的23種有效成分[14]。Hara等[15]利用基因芯片分析抗腫瘤草藥黃連根及其8個組成分子的12600個基因，經(jīng)過生物信息學(xué)技術(shù)處理，已經(jīng)確定黃連中抗增殖的有效成分是黃連素。

3.3中藥藥材鑒定準(zhǔn)確地鑒定中藥藥材是保證中藥臨床用藥安全準(zhǔn)確有效的前提。我們過去常依據(jù)藥物的來源、性質(zhì)等基本特征進行鑒定，但各有局限性，因而難于滿足中藥鑒別的需要。有學(xué)者提出利用生物芯片技術(shù)可對中藥的基因進行鑒定。應(yīng)用基因芯片技術(shù)可實現(xiàn)中藥品種快速、準(zhǔn)確、自動化鑒定，保證臨床用藥的安全性與有效性。如果將中藥材某些特異基因測序完成后，可將各種中藥材的特異基因的特異核苷酸序列探針做成基因芯片，就可以非常準(zhǔn)確地鑒別藥材的真?zhèn)?。Zhang YB等[16]利用基因芯片技術(shù)對中藥石斛的不同種屬進行了鑒別，將16個不同種屬石斛的ITS1-5．8S．ITS2序列固定于玻片上制作了基因芯片，并用熒光標(biāo)記的ITS2序列作為探針，可檢測出5種被記載的石斛。

4 基因芯片技術(shù)在針刺研究中的應(yīng)用

隨著針灸的不斷發(fā)展，其作用機制成為近來研究的熱點，揭示針刺作用機制能夠更好的提高其臨床療效。針灸作用于人體后，能引起人體神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫，消化等多個系統(tǒng)的反應(yīng)，但針灸的信號是如何在細胞內(nèi)外傳遞的過程仍不清楚；此外，不同的針刺條件，比如不同的頻率、幅度、時間，強度等會產(chǎn)生不同的療效。針刺作用機制的研究一直沒有太大的進展，如果利用基因芯技術(shù)可檢測針刺時細胞內(nèi)外基因表達的差異，再利用蛋白組學(xué)、生物信息學(xué)等技術(shù)進行分析，有可能揭示針刺作用機制。楊麗萍等[17]用基因芯片技術(shù)檢測腎陽虛證骨關(guān)節(jié)炎患者及壓正常人的基因表達譜，以及針灸治療顯效者的治療前后基因表達譜的變化。結(jié)果篩選出與腎陽虛骨關(guān)節(jié)炎免疫相關(guān)的基因13條，腎陽虛骨關(guān)節(jié)炎患者與正常人相比表達下調(diào)4條，上調(diào)5條。通過對13條免疫相關(guān)基因的功能分析，初步認為腎陽虛骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生涉及多種免疫相關(guān)基因，溫針灸可能是通過調(diào)控多基因的表達來實現(xiàn)其治療作用。王米渠等[18]應(yīng)用基因芯片研究針刺涌泉穴對D一半乳糖所致衰老大鼠基因表達的影響，初步篩選出了差異表達基因318條，其中表達上調(diào)的有137條，表達下調(diào)的有181條，并對其中差異最為顯著的55條作了初步分析。針刺涌泉穴對衰老大鼠的基因表達的影響涉及免疫、生長發(fā)育、基礎(chǔ)代謝和細胞骨架運動等多個方面，這從基因水平證明了針刺治療是一整體調(diào)節(jié)作用。

5 結(jié)論

基因芯片技術(shù)以其自身的優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥各領(lǐng)域的研究中，它使中醫(yī)藥的發(fā)展和研究更加現(xiàn)代化、標(biāo)準(zhǔn)化、客觀化，準(zhǔn)確化。雖然基因芯片技術(shù)費用相對昂貴，技術(shù)手段還處于探索研究階段，部分芯片特異性、敏感度相對較低等因素局限了其在中醫(yī)藥各領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展，但其在中醫(yī)證基因表達差異分析、中藥作用機制、中藥篩選及針刺機制研究等方面已發(fā)揮出重大作用，為我們更好地研究祖國醫(yī)藥開辟了一條新的道路，所以仍有廣闊的發(fā)展和應(yīng)用前景。隨 著生物信息學(xué)的發(fā)展，基因芯片技術(shù)會在生命科學(xué)研究的更多方面顯示出它的價值，也會更好的促進中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展。

[1]武瑞，連學(xué)昭．基因芯片技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2005，24(1)；21-23.

[2]Chen MH,Ibrahim JG，Chi YY．A new class of mixture models for differential gene expression in DNA microarray data[J].J Statist Planning Infer，2008，138(2)：387.

[3]Pal NR，Aguan K，Sharma A，et al．Discovering biomarkers from gene expression data for predicting cancer subgroups using neural networks and relational fuzzy clustering[J].BMC Bioinformatics，2007，8(5)：1.

[4]JainKK．Bioehlp h gone spotting[J].Science,2001,294(5542):621-623.

[5]吳敦序，劉燕池，李德新，等．中醫(yī)基礎(chǔ)理論[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2004:7.

[6]沈白尹．基因科學(xué)和21世紀(jì)中醫(yī)藥學(xué)的走向[J].上海中醫(yī)藥雜志，2000(10)：7-9.

[7]柴可夫，黃曉玲，錢俊文,等．2型糖尿病中醫(yī)濕熱困脾證的基因表達研究[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)報,2009,35(5):688-692.

[8]潘志強，方肇勤，盧文麗，等．肝癌小鼠不同階段有關(guān)證候腎上腺差異表達的基因分析[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報,2008,6(8):843-851.

[9]吳元勝，范瑞強．陳紅，等．基因芯片技術(shù)分析SLE證候基因表達的初步研究[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2003,16(12):1683.

[10]倪紅梅，何裕民，方盛泉，等．青少年腎陽虛體質(zhì)差異表達基因的篩選研究探析[J].江蘇中醫(yī)藥,2007,39(10):26-28.

[11]荊志偉，王忠，高思華，等.基因芯片技術(shù)與中藥研究——中藥基因組學(xué)中國中醫(yī)科學(xué)院[J].中國中藥雜志，2007,2(4).

[12]于華蕓，王世軍，季旭明，等．基因芯片技術(shù)研究大黃“ 清熱瀉火解毒”作用機制[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2010,5(7):572-575.

[13]祁冰，宋家欣，楊琳，等.基因芯片研究隱丹參酮對胰島素抵抗卵巢顆粒細胞基因表達的影響[J].科技導(dǎo)報，2009,27(15):39-43.

[14]徐仿周，吳繼洲.基因芯片技術(shù)在中藥中的應(yīng)用研究進展[J].國外醫(yī)學(xué)藥學(xué)分冊[Foreign Med Sci(section of Pharamcy)],2005,32(15):300-305.

[15]Hsrs A，Iizuka N，Hamamoto Y，et al.Molecular dissection of amed icinal herb with anti-tumor activity by oligonucleotide microarmy[J].Lifo Sci，2005，77(9)：991.

[16]Zhang YB，Wang J，Wang Zr，et al.DNA microarray for identiflcation of the herb of dendrobium species from Chimedicinal[J].

[17]楊麗萍，王明臣，王米渠，等．基因芯片技術(shù)研究針灸對腎陽虛證骨關(guān)節(jié)炎患者免疫相關(guān)基因表達的影響[J].遼寧中醫(yī)雜志，2006，33(3)：257-258.

[18]王米槊，張衛(wèi)，李王民，等．基因芯片篩選針刺衰老鼠涌泉穴的318個差異表達基因初報[J].中國中西醫(yī)結(jié)臺雜志，2002，22(11)：928.