雷萬軍，楊建英，崔 磊

基于干細胞的骨組織工程研究與臨床應用

Clinical Research and App lication on Stem Cell-based Bone Tissue Engineering

雷萬軍，楊建英，崔 磊

目的尋找滿足要求和易于操作的種子細胞。方法 參閱國內(nèi)外相關文獻，對近年來干細胞的骨組織工程的應用研究作一綜述。結果干細胞的研究為解決組織工程種子細胞來源問題開辟了新的途徑。結論滿足要求和易于操作的種子細胞為脂源性干細胞。

干細胞；骨組織工程；脂源性干細胞

組織工程是應用細胞生物學和工程學的原理和技術，構建有生物活性的組織用于損傷組織或器官的修復。隨著組織工程研究在世界范圍內(nèi)的迅猛開展，組織工程技術構建組織、器官方法的日趨完善。骨創(chuàng)傷修復雄厚的理論與研究基礎，各種生物材料在臨床治療骨缺損的廣泛應用，為骨組織工程研究提供了雄厚的基礎。在此基礎上，骨組織工程的研究已處于組織工程化組織構建與缺損修復的前沿，是可能率先正式進入臨床應用的組織工程化組織之一。

尋找滿足要求和易于操作的種子細胞是組織工程的關鍵環(huán)節(jié)。對于骨組織工程而言，理想的種子細胞應具有以下幾個特點：取材容易，對機體的損傷??；在體外培養(yǎng)中有較強的傳代繁殖力且成骨細胞表型不易丟失；植入機體后能適應受區(qū)生理、病理、應力等環(huán)境并保持成骨活性。早期成骨細胞多從骨膜［1］中獲取，但骨膜來源的成骨細胞體外培養(yǎng)易造成表型喪失，無法大量擴增；要達到體內(nèi)構建骨組織的細胞數(shù)，往往需要相當面積的骨膜，對機體造成新的創(chuàng)傷，應用受到很大限制。

干細胞的研究深入為解決組織工程種子細胞來源問題開辟了新的途徑。胚胎干細胞（embryonic stem cells，ES細胞）由于具有分化全能性與體外無限增殖的能力，將是未來組織工程種子細胞的重要來源。Buttery等［2］誘導ES細胞表達成骨細胞表型，獲得接近純化的成骨系ES細胞。但ES細胞很難獲得完全純化的特定細胞系，在體內(nèi)易形成畸胎瘤；而且其應用的倫理學問題尚未得到解決，目前離實際應用尚有距離。

成體干細胞中，骨髓間充質干細胞（bone marrow stem cells，BMSCs）具有多向分化潛能［3］，獲取時對機體損傷小，培養(yǎng)擴增后數(shù)量充足，且自體細胞避免了免疫排斥反應的特點，已經(jīng)成為骨組織工程最主要的種子細胞來源［4－5］。研究表明，BMSCs在骨髓中含量極低，成人骨髓平均104～105個有核細胞中含有1個hMSCs（相當于每毫升全骨髓中含有200 個BMSCs）；隨著年齡的增加，細胞數(shù)量逐漸減少［6］。但是，BMSCs具有非常強的體外擴增能力，我們發(fā)現(xiàn)在10%胎牛血清的單層培養(yǎng)體系中，傳至第7代時收獲的細胞數(shù)為（1～2）×109，較原始接種數(shù)目擴增可達（4～6）×107倍。BMSCs是一種具多向分化潛能的細胞，因此如何在體外培養(yǎng)過程中使它向成骨方向轉化，并在體內(nèi)保持這種特性至關重要。流式細胞術表面標志檢測及多向分化能力研究表明，BMSCs的干細胞特征隨著傳代的增加而減弱，干細胞表型在P5前維持穩(wěn)定，而原代開始成骨誘導處于第3代的BMSCs成骨活性最佳［7］。

在應用骨髓間充質干細胞進行骨組織構建的過程中，生物材料作為細胞載體，為誘導分化的BMSCs提供了生長空間與骨組織形成的“模板”，因此我們研究了BMSCs在多種生物材料上的生長規(guī)律與體內(nèi)成骨能力。研究證實，成骨誘導的BMSCs與藻酸鈣（calcium alginate）［8］、珊瑚羥基磷灰石［9］、珊瑚［10］、脫鈣骨（dem ineralized bonematrix，DBM）［11］等生物材料均具有良好的相容性。例如，單位重量脫鈣骨上存在人骨髓基質干細胞的最大黏附細胞數(shù)為3.5×107／g，黏附率可達（99.1±1）%［11］。BMSCs接種于上述生物材料并植入體內(nèi)后，均能夠形成組織工程化骨組織。

在骨髓間充質干細胞與生物材料的體內(nèi)外研究基礎上，我們進一步開展了應用BMSCs進行骨組織構建與骨組織缺損修復的大動物實驗研究。首先我們進行了應用BMSCs修復山羊非負重顱骨缺損的研究［12］，在2 cm×2 cm的顱骨標準缺損（critical size）中單純植入藻酸鈣凝膠，18周后骨缺損未得到任何修復；而在實驗組，體外成骨誘導的BMSCs擴增后與藻酸鈣凝膠復合，植入顱骨缺損部位，大體、X線、3D－CT及組織學檢測均證實組織工程化骨組織形成，骨缺損得到完全修復。研究結果證實了應用組織工程技術可以修復非負重的顱骨缺損，但是骨組織工程技術能否修復具有較高力學強度要求的負重骨缺損呢？下頜骨具有一定的負重能力，下頜骨缺損是顱頜面部缺損中最常見的骨缺損。本實驗室應用BMSCs復合生物材料珊瑚羥基磷灰石，修復了犬的下頜骨3 cm的節(jié)段缺損，32周組織學顯示形成較好的骨性連接，力學強度則達到自體對側下頜骨的77.01%［13］。股骨是負重能力最強的骨組織，我們應用自體BMSCs復合天然珊瑚，修復了2.5 cm的山羊股骨標準缺損，修復后32周X線顯示骨密度接近正常，組織學證實骨組織形成良好，基本達到正常對側的生物力學強度［14］。

在人體內(nèi)進行骨組織構建并修復骨組織缺損，是骨組織工程研究的最主要的目標。在前述大量實驗研究的基礎上，我們開展了應用病人自體BMSCs構建組織工程化骨，臨床修復骨組織缺損的研究工作［15］。1999～2002年，共選擇顱頜面骨缺損病11例（外傷性顱骨缺損4例，先天性梨狀孔周圍骨凹陷畸形7例），將誘導的自體BMSCs，復合部分脫鈣骨（partly demineralized bonematrix，pDBM）體外培養(yǎng)1周后，手術回植骨缺損區(qū)?；颊呷SCT檢查結果示術后3～6個月能形成組織工程化骨，并修復骨組織缺損。術后1～2.5 a的隨訪表明組織工程骨穩(wěn)定存在，無明顯骨吸收現(xiàn)象，臨床治療效果穩(wěn)定。組織工程骨活檢標本HE染色顯示其組織學結構和正常松質骨相同。研究結果證明以自體hBMSCs為種子細胞，利用組織工程技術可在人體內(nèi)形成穩(wěn)定的工程化骨組織，并臨床修復顱頜面骨組織缺損。這項研究的結果為組織工程骨的臨床大規(guī)模應用奠定了一定的基礎。

成體干細胞中另一重要的種子細胞來源是脂肪干細胞（adipose derived stem cell，ADSCs）。研究表明，脂肪干細胞具有體外向成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞等方向分化的多向分化潛能［16］。與骨髓間充質干細胞相比，ADSCs具有來源更加廣泛、細胞在組織中含量多、培養(yǎng)條件簡單且擴增能力強等特點，因此ADSCs在骨組織工程中的應用已經(jīng)得到普遍重視。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，成骨誘導的ADSCs與生物材料（羥基磷灰石－TCP）復合后，能夠在免疫缺陷的裸鼠皮下形成骨樣組織，提示ADSCs在骨組織工程應用中具有較大的潛能［17］。但是，應用ADSCs修復大動物骨組織缺損的研究目前尚未見報道。

以自體成體干細胞作為種子細胞進行組織工程化骨組織的構建研究，已經(jīng)取得了較大的進展，并已在臨床應用中得到初步證實。但是，由于自體干細胞的體外培養(yǎng)與擴增需要較長的一段時間，往往不能滿足大多急性骨損傷的臨床實際需要，能否應用同種異體干細胞進行骨組織的構建與缺損的修復，已經(jīng)成為骨組織工程研究的一個新的領域。免疫學研究表明，正常狀態(tài)下BMSCs不表達HLAII類抗原、B7-1、B7-2、CD40、CD40L等免疫調(diào)節(jié)分子［18］；BMSCs在體外可抑制混合淋巴細胞反應，體內(nèi)系統(tǒng)性應用BMSCs可明顯延長異體皮片移植的成活時間［19］，在造血干細胞移植時同時移植BMSCs可明顯降低移植物抗宿主反應［20］。這些研究結果提示成體組織干細胞具有較為特殊的免疫學特性與免疫調(diào)節(jié)功能，同種異體的成體干細胞具有作為骨組織工程種子細胞來源的重要潛能。最近的研究［21］表明同種異體骨髓間充質干細胞復合HA／TCP能修復犬股骨2.1 mm的節(jié)段缺損，而不需要進行免疫抑制治療。同種異體BMSCs也已在臨床中用于先天性骨發(fā)育不良的治療。而針對ADSCs的免疫學研究表明，骨髓經(jīng)放射線照射滅活的小鼠體內(nèi)輸注ADSCs后，其造血與淋巴細胞可在體內(nèi)重新生成，表明ADSCs在特定體內(nèi)環(huán)境下可促進淋巴細胞的發(fā)生［22］。我們實驗室的研究進一步發(fā)現(xiàn)［23］，ADSCs具有與BMSCs相近的低免疫原性，同時具有一定的調(diào)節(jié)免疫反應的能力，可抑制混合淋巴細胞的體外增殖反應。因此，在未來的骨組織工程應用中，可通過建立成體干細胞（骨髓間充質干細胞、脂肪干細胞）庫，即能更及時方便地應用組織工程方法來修復骨缺損。

組織工程是一門多學科交叉的新興學科，各學科的研究進展通過與組織工程的學科特點相互融合，為組織工程學的發(fā)展提供了不斷的動力，推動了組織工程學科的整體進步。干細胞的研究大大拓展了組織工程種子細胞的來源，為組織工程的臨床應用奠定了切實可行的基礎。骨組織工程即在干細胞研究飛速發(fā)展的背景下，在組織構建與臨床應用等方面取得重大突破。在骨組織工程的干細胞研究中，一方面需要建立干細胞的體外標準化培養(yǎng)與質量控制體系，以適應骨組織工程產(chǎn)業(yè)化的需要；另一方面，應該結合組織工程化組織形成的生物學特點，深入研究干細胞在體外三維生長條件下及體內(nèi)不同微環(huán)境中，成骨能力的變化與骨組織形成的特點，從而為組織工程化骨組織的構建提供更加優(yōu)良的干細胞來源與成骨環(huán)境。

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1672－688X（2012）04－0318－03

2012－07－10

河南科技大學醫(yī)學技術與工程學院，河南洛陽471003

雷萬軍（1954－），男，河南鞏義人，教授，從事生物醫(yī)學工程教學及科研工作。

崔磊，男，教授，E-mail：cuileite＠yahoo.com.cn