陳 媛 ，吳惠勤*，杭義萍，黃曉蘭，黃 芳，朱志鑫，林曉珊，羅輝泰

（1.華南理工大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，廣東 廣州 510640；2.中國(guó)廣州分析測(cè)試中心 廣東省分析測(cè)試技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070）

釀造醬油是以大豆或脫脂大豆、小麥或麩皮為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵釀制成的具有特殊色、香、味的液體調(diào)味液[1]。目前市場(chǎng)上出現(xiàn)了配制醬油和水解植物蛋白液[2]冒充釀造醬油的現(xiàn)象，為了鑒別釀造醬油與水解醬油，有人對(duì)醬油的香氣成分、游離氨基酸以及水解醬油中的有害物質(zhì)進(jìn)行了研究[3-14]。但是針對(duì)醬油中的多肽的水解氨基酸的研究未見(jiàn)報(bào)道。醬油發(fā)酵過(guò)程中所產(chǎn)生的一系列極其復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，與微生物和生物化學(xué)有著密切的關(guān)系。其中，原料中的蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下，水解生成胨、肽及氨基酸。但蛋白酶不能將所有的蛋白質(zhì)都酶解為氨基酸，釀造醬油中還保留大量的中間產(chǎn)物——肽類(lèi)等物質(zhì)。而酸水解植物蛋白液是以含有食用植物蛋白的脫脂大豆等原料經(jīng)鹽酸水解，堿中和制成的液體調(diào)味液，制作過(guò)程一般原料用6mol/L鹽酸在110℃條件下水解22h而成，水解反應(yīng)過(guò)程劇烈，其中間產(chǎn)物——肽類(lèi)的含量與釀造醬油不同。本研究旨在找出二者中間產(chǎn)物肽類(lèi)的水解氨基酸含量和組成上的差異，為鑒別釀造醬油與水解醬油提供依據(jù)?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的只有使用高效液相色譜或氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)醬油中的游離氨基酸，目前還沒(méi)有人做過(guò)使用HPLCMS/MS檢測(cè)醬油中肽類(lèi)的氨基酸組成的研究。而HPLCMS/MS的優(yōu)勢(shì)在于采用“母離子>子離子”的多反應(yīng)檢測(cè)模式（MRM），大大提高檢測(cè)的靈敏度和選擇性，而且可針對(duì)不同化合物同時(shí)選擇多對(duì)不同的檢測(cè)離子，實(shí)現(xiàn)多組分同時(shí)檢測(cè)的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

天然發(fā)酵醬油原油（不含任何添加劑），酸水解植物蛋白液：廣東珠江橋生物科技股份有限公司提供。氨基酸對(duì)照品谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴(lài)氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸：購(gòu)自Sigma公司；鹽酸、正丁醇、甲醇、乙醇（分析純）：廣州化學(xué)試劑廠；乙腈（色譜純）：德國(guó)Merck公司；實(shí)驗(yàn)室用水為雙蒸水。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200LC/6410B MS液相色譜/串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，由二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，Thermo BDS HYPERSIL C18色譜柱組成；勝譜實(shí)驗(yàn)電熱板；DHG-9041A型電熱恒溫干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；XW-80A旋渦混合器：江蘇海門(mén)市麒麟醫(yī)用儀器廠；TDZ5-WS平衡離心機(jī)：湖南賽特湘儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理方法

多肽物質(zhì)提取及水解：分別取5mL樣品水浴80℃條件下蒸干，加入10mL 70%vol乙醇超聲，振蕩，4000r/min離心5min，倒掉上清液，沉淀加入5mL70%vol乙醇重復(fù)洗滌一次，倒掉上清液，沉淀用氮?dú)鈸]干乙醇，用16mL 6mol/L鹽酸溶解，裝入20mL的頂空進(jìn)樣瓶，抽真空充氮?dú)?，加?滴重蒸苯酚。110℃于恒溫干燥箱中水解22h。水解后樣品過(guò)濾到燒杯中，電熱板80℃蒸干鹽酸，加5mL雙蒸水，取1mL定容至50mL。

水解氨基酸衍生化：水解得到的溶液100μL于2mL進(jìn)樣瓶中，80℃氮?dú)馑〈蹈?，加?0μL 2.5mol/L鹽酸正丁醇，壓蓋，渦旋混勻，80℃衍生40min，取出后氮?dú)獯蹈桑?mL80%乙腈水溶液渦旋1min，過(guò)0.20μm有機(jī)濾膜，HPLC-MS/MS測(cè)定[15]。

1.3.2 分析條件

色譜條件：Thermo BDSHYPERSILC18色譜柱（150mm×2.1mm，2.4μm），流動(dòng)相A為10mmol/L甲酸銨（含0.2%甲酸），B為乙腈。梯度洗脫程序：0～5min，0%～40%B；5.1min～7min，40%～80%B；7min～8min，80%～0%B；8min～12min，0%～0%。流速0.2mL/min；進(jìn)樣量：1μL；柱溫：30℃。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子電離模式，干燥氣（N2）溫度為350℃，霧化氣（N2）壓力為275.8kPa，干燥氣（N2）流量10.0L/min，電噴霧電壓4000V，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，質(zhì)譜分析參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 氨基酸的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 HPLC-MS-MS parameters of amino acid

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱(chēng)量氨基酸對(duì)照品用0.1mol/L鹽酸溶解配制成含每種氨基酸200mg/L（其中谷氨酸和天冬氨酸濃度為400mg/L），再稀釋成1mg/L、0.5mg/L、0.1mg/L、0.01mg/L、0.001mg/L系列濃度，按1.3.1衍生化方法進(jìn)行衍生，上機(jī)。

1.4 計(jì)算公式

標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算水解氨基酸含量：

2 結(jié)果與討論

2.1 沉淀多肽的溶劑及其濃度的選擇

試驗(yàn)了30%vol、50%vol、70%vol、90%vol乙醇和70%vol甲醇作沉淀劑沉淀多肽的效果，其總離子流圖見(jiàn)圖1，由圖1看出，70%vol乙醇沉淀出的多肽的水解氨基酸峰高最高，證明70%vol乙醇沉淀出的多肽最多，實(shí)驗(yàn)效果最好。沉淀后的多肽在水解前用5mL70%vol乙醇溶解，按1.3.1的方法相同條件下進(jìn)行衍生，得到釀造醬油和水解醬油空白樣。其與多肽水解氨基酸的總離子流圖見(jiàn)圖2，結(jié)果證明，70%vol乙醇基本能把除多肽以外的游離氨基酸洗掉，沒(méi)有游離氨基酸的干擾，得到的沉淀物是不溶于70%vol乙醇的多肽，其水解后得到的氨基酸完全是組成多肽的氨基酸。

圖1 30%vol，50%vol，70%vol，90%vol乙醇與70%vol甲醇作沉淀劑峰面積圖Fig.1 Peak area of 30%vol，50%vol，70%vol，90%vol ethanol and 70%vol methanol precipitate

2.2 方法的精密度，線性范圍，檢出限和定量限

按1.3.3方法測(cè)定得氨基酸對(duì)照品的峰面積，以峰面積為Y值，氨基酸質(zhì)量濃度為X值對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明在0.001mg/L～1.0mg/L濃度范圍內(nèi)，16種氨基酸的峰面積和濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為0.998以上。精密取6份天然發(fā)酵醬油原油，按1.3.1樣品衍生方法處理上機(jī)，測(cè)定方法的精密度，結(jié)果表明，各氨基酸的RSD在1.05%～8.88%范圍內(nèi)。16種氨基酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，回歸方程，按3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限和按10倍信噪比計(jì)算方法的定量限（S/N=10）見(jiàn)表2。

2.3 多肽的水解氨基酸的含量及相對(duì)百分含量

圖2 70%vol乙醇沉淀水解油后的空白樣(a)，沉淀天然釀造醬油原油的空白樣(b)，F(xiàn)SS(c)和HVP(d)的多肽水解氨基酸總離子流圖Fig.2 TIC of 70%vol ethanol blank sample of HVP (a) and FSS (b),FSS (c) and HVP (d) hydrolyzed amino acids in peptide

表2 16 種氨基酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，回歸方程，檢出限和定量限Table 2 The relative standard deviation of 16 kinds of amino acids,the regression equations,limit of detection and limit of quantitation

由天然釀造醬油原油和酸水解植物蛋白液的多肽的液相色譜-質(zhì)譜總離子流圖，選擇MRM模式，提取16種氨基酸的檢測(cè)離子，各色譜峰經(jīng)質(zhì)譜母離子、子離子，相對(duì)保留時(shí)間定性，氨基酸對(duì)照品定量，分別得到16種水解氨基酸的含量，計(jì)算其相對(duì)百分含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 天然發(fā)酵醬油原油和水解植物蛋白液水解氨基酸含量及其相對(duì)百分含量Table 3 Hydrolyzed amino acids content and the relative content of FSS and HVP

由表3可以看出，天然發(fā)酵醬油原油中組成多肽的水解氨基酸總量約是酸水解植物蛋白液的10倍，F(xiàn)SS中多肽的總量為2378.76mg/L，HVP中多肽的總量為247.57mg/L。其中FSS中組成多肽必需氨基酸的總量是700.68mg/L，占總氨基酸的29.46%。HVP組成多肽的必需氨基酸的總量是60.33mg/L，占總氨基酸的24.37%。說(shuō)明天然發(fā)酵醬油原油的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于酸水解植物蛋白液。從組成多肽的水解氨基酸的總量可以區(qū)分天然釀造醬油和酸水解植物蛋白液。

對(duì)各種水解氨基酸的質(zhì)量濃度進(jìn)行比較，F(xiàn)SS中排名前五位的水解氨基酸分別為谷氨酸、天冬氨酸、亮/異亮氨酸、賴(lài)氨酸、絲氨酸，其質(zhì)量濃度分別為462.29mg/L、437.63mg/L、245.99mg/L、158.50mg/L、157.16mg/L。HVP中排名前5位的水解氨基酸分別為谷氨酸、天冬氨酸、亮/異亮氨酸、丙氨酸、脯氨酸，其質(zhì)量濃度分別為62.08mg/L、35.12mg/L、24.93mg/L、22.94mg/L、19.66mg/L。從組成多肽的水解氨基酸的含量可知，F(xiàn)SS和HVP的水解氨基酸含量差異較大，其中谷氨酸和天冬氨酸所占比例最多，這與原料中組成蛋白質(zhì)的氨基酸比例有很大關(guān)系，有研究表明，大豆蛋白質(zhì)中谷氨酸和天冬氨酸含量最多，蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸含量很少[16-17]，另外色氨酸在酸水解條件下會(huì)和含醛基的化合物（如糖）作用生成黑色物質(zhì)而被破壞掉，蛋氨酸、半胱氨酸含有硫原子，水解的過(guò)程也很容易被氧化掉，所以FSS和HVP的水解氨基酸中都未檢測(cè)到蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸。醬油中的肽多為酸性肽，醬油中的多肽顯味性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于游離氨基酸，但是肽能增強(qiáng)醬油味道的厚度和延長(zhǎng)味的持續(xù)性，在烘托游離氨基酸的鮮味、甜味、苦味表現(xiàn)上十分重要。亮氨酸和異亮氨酸是同分異構(gòu)體，相對(duì)分子質(zhì)量相同，都是131.2g/moL，與正丁醇酯化后加上一個(gè)酯基，分子量增加57，所以其檢測(cè)離子對(duì)都是188>86，又因?yàn)槠錁O性相同，在本文色譜條件下同時(shí)出峰，實(shí)際檢測(cè)到的是2種氨基酸的含量，所以其質(zhì)量濃度比較大，在FSS和HVP中都排在第三位。賴(lài)氨酸是人體的第一必需氨基酸，在人體新陳代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，由于谷物食品中的賴(lài)氨酸含量甚低，且在加工過(guò)程中易被破壞而缺乏，故稱(chēng)為第一限制性氨基酸。天然發(fā)酵醬油原油中賴(lài)氨酸在多肽中的含量21倍高于酸水解植物蛋白液，其中FSS中賴(lài)氨酸的含量為158.50mg/L，HVP中賴(lài)氨酸的含量為7.56mg/L。所以可以從組成醬油多肽的賴(lài)氨酸的含量分析區(qū)分天然釀造醬油和酸水解植物蛋白液。

FSS多肽中賴(lài)氨酸、組氨酸、酪氨酸相對(duì)百分含量約是HVP的2倍。FSS多肽中賴(lài)氨酸、組氨酸、酪氨酸相對(duì)百分含量分別是6.66%、2.24%、3.02%，而HVP多肽中這3種氨基酸相對(duì)百分含量分別是3.05%、1.18%、1.12%。HVP中丙氨酸、脯氨酸相對(duì)百分含量約是FSS的2倍。HVP多肽中丙氨酸、脯氨酸相對(duì)百分含量分別是9.26%、7.94%，F(xiàn)SS多肽中這2種氨基酸相對(duì)百分含量分別是5.76%、4.56%。以上表明FSS和HVP中個(gè)別氨基酸的相對(duì)百分含量存在數(shù)量上的倍數(shù)關(guān)系，鑒于此可以從單個(gè)水解氨基酸的相對(duì)百分含量鑒別天然釀造醬油和酸水解植物蛋白液。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用HPLC-MS/MS方法分別對(duì)天然發(fā)酵醬油原油和酸水解植物蛋白液中的多肽的水解氨基酸的含量和比例進(jìn)行了研究，除蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸未檢出外其他16種氨基酸均得到很好的檢出。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FSS中的多肽總量約為HVP的10倍，其中多為酸性肽，谷氨酸和天冬氨酸的占比接近40%。FSS中的賴(lài)氨酸、組氨酸、酪氨酸相對(duì)百分含量是HVP的2倍。其中FSS中賴(lài)氨酸的含量為158.5mg/L，是HVP的21倍，所以賴(lài)氨酸可以作為一種特征氨基酸判定是否為水解植物蛋白液。本研究也為質(zhì)檢系統(tǒng)對(duì)醬油的檢測(cè)提供新的思路。

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