陳 杰，趙雨薇，倪永清，鄭曉吉，史學(xué)偉*

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.新疆張?jiān)０捅Ｄ芯艟魄f有限公司，新疆 石河子 832000）

酵母菌是自然界中分布較廣的真菌，因其用途廣泛而引起高度關(guān)注。近年來(lái)國(guó)內(nèi)對(duì)母菌的多樣性研究已涉及到云南的熱帶雨林、秦嶺地區(qū)以及天山極地凍土等[1-3]。西班牙、匈牙利、葡萄牙、意大利和美國(guó)伊利湖等國(guó)家和地區(qū)對(duì)葡萄及葡萄園中酵母菌的多樣性已經(jīng)展開(kāi)了大量的研究[4]。

酵母菌是葡萄酒品質(zhì)的靈魂，對(duì)于葡萄酒的香氣、色澤、感官質(zhì)量和風(fēng)格的影響至關(guān)重要，利用不同菌種發(fā)酵而生產(chǎn)出的葡萄酒，其酒質(zhì)和風(fēng)味大不一樣。目前，我國(guó)在葡萄酒酵母菌的研究和利用等方面還處在起步階段，生產(chǎn)葡萄酒所用的酵母菌種大部分依賴于進(jìn)口，而用單一菌種接種的純種發(fā)酵會(huì)使得葡萄酒失去其特有的香氣和風(fēng)味[5]。所以對(duì)于酵母菌的多樣性和種質(zhì)的研究，以及及時(shí)解決單一菌種的純種發(fā)酵的問(wèn)題將是以后我國(guó)酵母菌研究的重點(diǎn)，并且使用地方的特色菌種來(lái)接種發(fā)酵或者與其他接種物混合進(jìn)行發(fā)酵，生產(chǎn)出具有地方特色的葡萄酒將會(huì)是葡萄酒行業(yè)未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)[6-7]。

新疆地區(qū)具有獨(dú)特的氣候和特殊的地理?xiàng)l件，已經(jīng)成為我國(guó)優(yōu)質(zhì)葡萄酒生產(chǎn)最具競(jìng)爭(zhēng)力的地區(qū)之一。石河子市屬中溫帶大陸性干旱半干旱的氣候，冬季嚴(yán)寒，夏季酷熱，日照充足，干燥少雨，蒸發(fā)量大，降水少，溫差較懸殊。

本研究在新疆石河子地區(qū)采集菌株，分離純化后，對(duì)可培養(yǎng)酵母菌DNA提取后，用26SrDNA D1/D2和ITS區(qū)序列擴(kuò)增及檢測(cè)，根據(jù)同源性序列來(lái)對(duì)待測(cè)酵母進(jìn)行分類，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行生物多樣性分析。初步探明我國(guó)新疆地區(qū)葡萄釀酒酵母菌的種質(zhì)多樣性及分類地位，為今后葡萄釀酒酵母菌篩選和育種工作提供寶貴的種質(zhì)資源和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器和試劑

用于PCR擴(kuò)增的全套試劑及擴(kuò)增引物均購(gòu)自于TaKaRa公司，相關(guān)耐性試驗(yàn)所用試劑均購(gòu)自于天津市巴斯夫化學(xué)試劑廠，高速冷凍離心機(jī)為Eppendorf公司5810R型，PCR儀為Techne公司TC-512型，凝膠成像系統(tǒng)為BioRad公司Gel DOCXR型，水平電泳儀為美國(guó)BioRad公司PowerPac Universal型。

1.1.2 培養(yǎng)基

YPD（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）培養(yǎng)基，121℃滅菌20min。

1.2 樣品采集

2010年9月23日采取的葡萄果實(shí)及葡萄園土樣（采樣地點(diǎn)：新疆石河子中信葡萄酒業(yè)有限公司葡萄試驗(yàn)園）。

1.3 菌株的分離與純化

菌株分離純化采用YPD培養(yǎng)基。

菌株分離的方法：將成熟的果粒破碎、帶皮進(jìn)行自然發(fā)酵。待發(fā)酵啟動(dòng)后，每日取lmL發(fā)酵液，以不同梯度稀釋夠涂布在YPD培養(yǎng)基上，在28℃培養(yǎng)48h后，挑取單個(gè)菌落，經(jīng)多次平板劃線純化，獲得純培養(yǎng)物（菌株）。純化后的菌株在斜面上進(jìn)行保存，并存于-20℃冰箱備用[8-9]。

1.4 形態(tài)學(xué)的鑒定

酵母菌的常規(guī)鑒定方法依據(jù)《酵母的特征及鑒定手冊(cè)》和《微生物分類學(xué)》，試驗(yàn)方法參照《微生物學(xué)試驗(yàn)技術(shù)》。

1.4.1 顯微特征

①細(xì)胞形態(tài)特征：橢圓形、球形、卵球形、倒卵形、柱狀、棒狀、針形、桿狀、長(zhǎng)桿狀、螺旋形、三角形、新月形或其他形狀；

②細(xì)胞為單生、對(duì)生或群生；

③繁殖方式：?jiǎn)味搜恐?、多邊芽殖，兩端芽殖或裂殖?/p>

1.4.2 固體宏觀特征

將活化好的酵母菌株接種在新鮮的YPD平板，在25℃培養(yǎng)1d～7d，觀察并記錄：

①菌落顏色：乳白色、奶油色，橙色、紅色、黃色或粉紅、玫紅；

②菌落質(zhì)地：奶酪狀，粘稠，松脆或堅(jiān)韌；

③菌落表面特征：光滑或粗糙、有光澤或暗淡、皺褶、條紋、有突起；

④菌落邊緣：平滑（全緣）、裂葉狀、、蝕刻狀、波浪狀、須狀或根狀；

⑤隆起：菌落平坦或隆起。

1.5 26SrDNA基因PCR擴(kuò)增和系統(tǒng)進(jìn)化分析

1.5.1 DNA的提取

用接種環(huán)挑取少量供試酵母菌種，懸浮于100μL裂解液（100mmol/LTris，30mmol/LEDTA，0.5%SDS，pH值為8.0）中，在100℃水浴15min，冷卻之后加入100μL 2.5mol/L醋酸鉀（pH值為7.5），混勻后，置于冰中1h，10000r/min離心10min，取上層清液，加入等體積的氯仿-異戊醇（24:1），劇烈震蕩后，10000r/min離心10min，取上清液，用等體積的氯仿異戊醇重復(fù)處理1次，加入相等體積預(yù)冷后的異丙醇，混勻后在-20℃靜置15min，并以13000r/min離心15min，沉淀用100μL 70%vol和無(wú)水乙醇分別各洗滌1次，真空抽干后加入50μL無(wú)菌水，溶解后在-20℃保藏備用[10]。

1.5.2 PCR擴(kuò)增與測(cè)序

使用引物NL1：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAA AAG-3′和NL4：5′-GGTCCGTGTTTCAAG-3′PCR反應(yīng)體系總體積為50μL，每管中加入10×PCR buffer（Taq buffer with KCl）5μL；25mmol/L的MgCl26μL；10μmol/L引物各2.5μL：10mmol/L dNTPs1μL；Taq酶2.0U，模板DNA 1μL；加雙蒸水至50μL。PCR循環(huán)為95℃、5min，95℃、1min，52℃、2min，72℃、1min，循環(huán)次數(shù)為35次，72℃延伸10min[11]。

1.5.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序

PCR產(chǎn)物首先用EZ-10 column PCR Product Purification kit（BIO BASIC INC，Canada）進(jìn)行純化后，在自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，利用BLAST進(jìn)行相關(guān)序列的搜索查詢，并與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中現(xiàn)有的近緣菌株的序列進(jìn)行比較，從數(shù)據(jù)庫(kù)獲得相關(guān)屬、種的26SrDNA序列，建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。下載有關(guān)的酵母菌菌種的26Sr DNA D1/D2區(qū)序列，將所測(cè)得的序列采用CLUSTAL X 1.81軟件對(duì)齊序列[12]，采用鄰接法neighborjoining method計(jì)算進(jìn)化距離[13]，用MEGA v.4.0[14]軟件分析進(jìn)化樹(shù)分支模式的穩(wěn)定性，采用bootstrap法，重復(fù)次數(shù)為1000，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果分析

2.1 形態(tài)學(xué)特征

以下18個(gè)典型菌株分別來(lái)自2010年09月23日采樣所得葡萄品種：HES（赫爾松）、DBS（大白桑）、JX（京秀）、MGX（玫瑰香）、BXJ（白香蕉）、MXS-2（馬西斯）、JLN-2（佳麗釀）、HBKT（紅巴克特）、CXZ（赤霞株）、QHWE-4（齊哈維爾）、BLS-2（布列沙）、HZMT（黑扎馬特）、HQLM-2（黑齊良母）、ZZ-3（雜株）、SFR-3（賽芙蓉）、JLWSM-1（捷萊烏蘇姆）、XMO（西米奧）、BYM（白玉覔）、WDLT（沃德里特）。按照菌落形態(tài)（形狀、大小、高度、顏色、濕潤(rùn)、光澤、透明度、邊緣、表面形態(tài)）和細(xì)胞形態(tài)（圓形、橢圓形、檸檬形、半月形細(xì)胞，出芽或裂殖等）初步分為11類，見(jiàn)表1。

表1 酵母菌株的分類Table 1 Classification of yeast

2.2 酵母菌的DNA提取

采用酵母菌DNA微量提取法從純化后的酵母菌株中提取基因組DNA，其純度、濃度和完整性能滿足PCR擴(kuò)增反應(yīng)和測(cè)序要求。

2.3 26SrDNA D1/D2區(qū)擴(kuò)增

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)片段在500bp～750bp之間，符合酵母菌26SrDNA D1/D2區(qū)理論預(yù)期值（約為600bp），如圖1。

2.4 基于26SrDNA基因序列的酵母菌株系統(tǒng)發(fā)育分析

將26株酵母菌株所獲得的26SrDNA D1/D2區(qū)域序列提交NCBI，通過(guò)Blast工具在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中與已發(fā)表的26SrDNA D1/D2區(qū)域序列進(jìn)行同源性比較（表2），構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2），在基于26SrDNA D1/D2區(qū)域序列分析繪制的系統(tǒng)樹(shù)上，相同的種被歸在一個(gè)主分枝內(nèi)，表明其具有較近的親緣性，而不同的種卻在于不同的亞分枝上，顯示其在D1/D2區(qū)域序列上具有明顯區(qū)別。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖Fig.1 Agarose jel electrophoresis detection result of PCR amplification product

圖2 基于26S rDNA 序列的26株酵母菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of the 26 yeast strains based on partial 26S rDNA sequences

表2 分離菌株依據(jù)26SrDNA D1/D2 序列鑒定結(jié)果Table 2 Identification of the yeast strains based on sequence analysis of the 26S rDNAD1/D2

3 討論

本研究中，在新疆石河子地區(qū)采集野生酵母菌84株，通過(guò)細(xì)胞核菌落形態(tài)及26SrDNAD1/D2區(qū)域序列的測(cè)定等方法，對(duì)所分離的菌株進(jìn)行系統(tǒng)的分類及鑒定研究。得到以下結(jié)論：

（1）鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有菌株屬于6個(gè)屬，分別為：假絲酵母屬（Candida）、Meyerozyma屬、紅酵母屬（Rhodotorula）、孢漢遜屬（Hanseniaspora）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和畢赤酵母屬（Pichia），共有10個(gè)種，其中包括6個(gè)疑似種。

（2）新疆擁有獨(dú)特的地理環(huán)境和氣候，孕育出很多獨(dú)特的動(dòng)植物和微生物。本研究中發(fā)現(xiàn)了6株與GenBank已有模式菌株序列同源率低的酵母菌分別是Y2與Galactomyces geotrichumJN083822.1的同源率為98%，Y3與RhodotorulamucilaginosaGU373744.1的同源率為97%，Y4與MeyerozymaguilliermondiiHM988720.1的同源率為98%，Y5與Candida amapaeEU057556.1的同源率為98%，Y6和Y7與HanseniasporauvarumGU080043.1、HM988683.1的同源率為98%和97%等。根據(jù)Kurtzman酵母種類的劃分依據(jù)，同源相似率低于99%的，不能劃為同一個(gè)種，因此對(duì)于這些待鑒定的菌株可以初步認(rèn)定其是一個(gè)新種，有待進(jìn)一步的形態(tài)、生殖方式及生理生化鑒定結(jié)果的考證。

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