盧 健，馬 驥，陳 金，林庶茹

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)方劑學(xué)科，遼寧沈陽110032）

四逆散為臨床常用經(jīng)典復(fù)方，源于《傷寒論·辨少陰病脈證并治》（第318條），方由柴胡、炙甘草、枳實(shí)、芍藥組成。柴胡既可疏解肝郁，又可升清陽以使郁熱外透，為君藥；芍藥養(yǎng)血斂陰、柔肝平肝，為臣藥；枳實(shí)理氣消積，以利脾胃，為佐藥；炙甘草補(bǔ)益脾胃、調(diào)和諸藥，為使藥。全方共奏透解郁熱、疏肝理脾之能，又具緩急止痛、調(diào)和氣血之功。用于熱厥手足不溫，脘腹脅痛，瀉痢下重。本課題組前期通過對(duì)四逆散不同配伍干預(yù)實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）的效用研究，發(fā)現(xiàn)四逆散能夠干預(yù)實(shí)驗(yàn)性UC［1］。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討四逆散方中柴芍配伍對(duì)實(shí)驗(yàn)性UC大鼠IL-6和IL-17的作用，為研究古典經(jīng)方配伍的實(shí)驗(yàn)研究提供方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠（SPF級(jí)，00800161042）70只，雌雄各半，體重160 g～190 g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證編號(hào)：SCXK（滬）2008-0016。

1.1.2 藥物與試劑 四逆散由柴胡、芍藥、枳實(shí)、甘草以1∶1∶1∶1 比例組成。柴胡免煎顆粒（0909165）、芍藥免煎顆粒（0909053）、枳實(shí)免煎顆粒（0909086）、甘草免煎顆粒（0909050）均購(gòu)自江蘇省江陰天江藥業(yè)有限公司。陽性對(duì)照藥物固腸止瀉丸購(gòu)自沈陽市東北大藥房，批號(hào)：092440，由西安阿房宮藥業(yè)有限公司提供。上述藥物按臨床成人用量的6.3倍折算實(shí)驗(yàn)大鼠的用量。蛋白標(biāo)準(zhǔn)液、考馬斯亮藍(lán)溶液均購(gòu)自南京建成生物工程公司；完全福氏佐劑購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司；大鼠血IL-6、IL-17檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京邦定生物醫(yī)學(xué)公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 550型酶標(biāo)儀（美國(guó)BLO-RAD公司）；TDL-5-A型離心機(jī)（飛鴿牌Anke）（上海安亭科學(xué)儀器廠）；WS2-261-79型電熱恒溫水浴箱（北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠）；DY89-Ⅱ型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組、造模及給藥 根據(jù)“四逆散不同配伍干預(yù)實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎的效用研究”的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為正常組、模型組、陽性對(duì)照組、四逆散組、柴芍枳組、柴芍甘組和柴芍組7組，每組10只。采用免疫法造模［2］。刮取家兔新鮮結(jié)腸黏膜制成組織勻漿，將其以4000r/min速度離心30 min，取上清液提純，用Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，冷藏備用。使用時(shí)與等量完全福氏佐劑充分混勻，制成抗原乳化液。于造模第1天注射抗原乳化液，分別注射于大鼠的雙側(cè)足跖、腹股溝及背部，每只約需0.5 mL；第10天，第17天，第24天依同法注射。按1 mL/100 g體重的濃度分別配制藥物，于造模第2天開始分組給藥。

1.2.2 標(biāo)本的采集與制備 第29天給藥后，稱重，麻醉后于腹主動(dòng)脈取血，待測(cè)指標(biāo)；然后全部處死，剖取結(jié)腸，自肛門2 cm上約8 cm處，剖開、展平，肉眼觀察黏膜，作出結(jié)腸組織損傷積分比較；剩余部分結(jié)腸組織以多聚甲醛固定，做病理切片，HE染色，鏡下觀察。

1.2.3 標(biāo)本檢測(cè) 采用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定，嚴(yán)格按試劑盒要求操作（以IL-17檢測(cè)為例）。從冰箱取出大鼠血清；取出酶標(biāo)板，依照次序?qū)?yīng)分別加100 μL的標(biāo)準(zhǔn)品于空白微孔中；分別標(biāo)記樣品編號(hào)，加100 μL樣品于空白微孔中；在標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔中加50 μL的酶標(biāo)記溶液；36.2℃孵育反應(yīng)60 min；手工洗板6次，每次靜置25 s；每孔加底物A、B液各50 μL；36.2℃避光孵育反應(yīng)15 min；每孔加50μL終止液，終止反應(yīng)6 min；放入酶標(biāo)儀中檢測(cè)，采集數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS10.0處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

四逆散對(duì)實(shí)驗(yàn)性UC大鼠血清IL-6、IL-17的影響，結(jié)果見表1。

表1 四逆散對(duì)實(shí)驗(yàn)性UC大鼠血清IL-6和IL-17的影響（±s）

表1 四逆散對(duì)實(shí)驗(yàn)性UC大鼠血清IL-6和IL-17的影響（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與陽性對(duì)照組比較，3）P＜0.05；與四逆散組比較，4）P＜0.05

組別 n 血清IL-6（pg/mL） 血清IL-17（pg/mL）正常組 10 59.80±11.72 40.58±4.31模型組 10 163.64±22.171） 130.83±24.381）陽性對(duì)照組 10 96.45±8.712） 64.83±10.782）四逆散組 10 73.00±9.922）3） 52.40±8.492）3）柴芍枳組 10 131.75±31.932）3） 48.98±5.612）3）柴芍甘組 10 66.65±11.162）3） 64.12±7.621）2）4）柴芍組 10 165.95±26.883）4） 56.43±6.422）

由表1可以看出，與正常組比較，模型組大鼠血清IL-6、IL-17含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對(duì)照組、四逆散組、柴芍枳組和柴芍甘組大鼠血清IL-6、IL-17均顯著降低（P＜0.05），柴芍組血清 IL-17明顯降低（P＜0.05）；與陽性對(duì)照組比較，四逆散組和柴芍甘組大鼠血清IL-6顯著降低（P＜0.05），柴芍枳組和柴芍組大鼠血清IL-6顯著升高（P＜0.05），四逆散組和柴芍枳組大鼠血清IL-17顯著降低（P＜0.05）；與四逆散組比較，柴芍枳組和柴芍組大鼠血清IL-6顯著增高，柴芍甘組大鼠血清IL-17顯著升高（P＜0.05）；柴芍組大鼠血清IL-6明顯高于柴芍枳組和柴芍甘組（P＜0.05），柴芍甘組大鼠血清IL-6顯著低于柴芍枳組（P＜0.05），柴芍甘組大鼠血清IL-17顯著高于柴芍枳組和柴芍組。

3 討論

UC以腹瀉、黏液膿血便、里急后重為主要表現(xiàn)，其病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，大多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為與遺傳、免疫、環(huán)境因素等密切相關(guān)。大量的臨床與實(shí)驗(yàn)研究均表明，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡失調(diào)是導(dǎo)致UC發(fā)病的重要因素［3］。IL-6由單核巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，能夠增強(qiáng)細(xì)胞和體液免疫介導(dǎo)的組織損傷，促進(jìn)B細(xì)胞增殖、分化，趨化炎性細(xì)胞進(jìn)入腸道病變部位，引起腸道炎癥和組織破壞。IL-17主要由Th1細(xì)胞產(chǎn)生，可促進(jìn)中性粒細(xì)胞的發(fā)育成熟，刺激IL-6等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生與分泌，是T細(xì)胞誘導(dǎo)和促進(jìn)炎癥發(fā)生過程中的一種重要因子。臨床研究表明，UC患者腸黏膜組織和血清中IL-6、IL-17水平均顯著升高［4-5］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，四逆散能夠降低UC大鼠血清IL-6含量，效果優(yōu)于對(duì)照藥物固腸止瀉丸；方中柴芍配伍對(duì)UC大鼠血清IL-6的作用不明顯，配伍枳實(shí)后，作用稍有增強(qiáng)，但配伍甘草后則發(fā)揮了重要作用，其作用趨勢(shì)甚至優(yōu)于四逆散全方組。

造模后，各給藥組實(shí)驗(yàn)大鼠血清IL-17含量均顯著降低；與陽性對(duì)照組比較，四逆散組顯著增多，柴芍枳組顯著降低；與四逆散組比較，柴芍甘組顯著升高；柴芍甘組顯著高于柴芍枳組和柴芍組。提示四逆散能夠降低UC大鼠血清IL-17含量，效果優(yōu)于對(duì)照藥物固腸止瀉丸；方中柴芍配伍發(fā)揮了主要作用，特別是配伍枳實(shí)后，其作用趨勢(shì)甚至優(yōu)于四逆散全方組，但配伍甘草后作用稍有減弱。

由此可見，四逆散能夠降低UC大鼠血清IL-6、IL-17水平，方中柴芍的君臣配伍對(duì)IL-17的影響發(fā)揮了主要作用，但對(duì)IL-6的作用不明顯，需配伍甘草后才能發(fā)揮重要作用。

［1］盧健，范穎，馬驥，等.四逆散及不同配伍干預(yù)潰瘍性結(jié)腸炎的研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（16）：109-112.

［2］徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.3版，北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1335.

［3］Goral V，Celenk T，Kaplan A，et al.Plasma cytokine levels in ulcerative colitis［J］.Hepato Gastroenterology，2007，54（76）：1130-1133.

［4］龐艷華，鄭長(zhǎng)青，王軼淳，等.IL-4和IL-13在潰瘍性結(jié)腸炎中的表達(dá)［J］.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2005，14（4）：410-412.

［5］王曉娣，董恩鈺.白介素-17在潰瘍性結(jié)腸炎表達(dá)的研究［J］.中華消化病雜志，2001，21（11）：673-676.