張 林，范 穎，陳文娜，李 然 ，孫宏偉，馬賢德

（1.遼寧中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院方劑學科，遼寧沈陽110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學教學實驗中心，遼寧沈陽110032）

大量研究表明，航天員在進入太空失重環(huán)境飛行過程中，骨質(zhì)丟失是一種必然發(fā)生的病理改變［1-2］。至今，尚未研究出對抗這種骨丟失安全有效的措施。近年來，祖國醫(yī)學在此方面多采用以補腎為主的方藥進行干預，取得了良好效果。然而中醫(yī)認為“腎主骨，脾主四肢”、“脾主運化，充養(yǎng)腎精，精生髓，髓養(yǎng)骨”。脾和腎對機體骨量維持恒定均具有重要作用，因此本研究在建立大鼠尾部懸吊模擬失重骨丟失模型的基礎(chǔ)上，著重探討補腎、健脾和補腎健脾三方對模擬失重腰椎骨丟失的防護作用，比較其異同，力求獲得有效的防護方藥。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性Wistar大鼠60只，級別SPF/VAF，體重（180±10）g，北京維通利華實驗動物中心提供。許可證號：SCXK（京）2006-0009。

1.1.2 實驗藥物 補腎方（BSD）：由鹿茸、淫羊藿等組成，健脾方：由生曬參、生黃芪等組成，補腎健脾方：由生曬參、

生黃芪、鹿茸、淫羊藿等組成，全部藥材購自北京同仁堂遼寧有限責任公司。補腎方和補腎健脾方中鹿茸打碎，過100目篩兌入藥液，三個方中其余藥物均采用常規(guī)水煎煮法提取，補腎方、健脾方和補腎健脾方將所得全部藥液混合依次濃縮成0.42 g原藥材/mL、0.56 g原藥材/mL、1 g原藥材/mL濃度備用。

1.1.3 實驗儀器 雙能X線骨密度分析儀：美國，Lunar；DMLA顯微照相系統(tǒng)：德國，Leica；硬組織切片機：德國，Leica。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與給藥 60只大鼠隨機分為：正常組（C）、懸吊組（S）、補腎組（SD）、健脾組（PD）和補腎健脾組（SPD）5組，每組12只。依據(jù)人和動物間體表面積折算的等效劑量比值表計算大鼠給藥劑量，SD、PD、SPD組大鼠從實驗第1天開始依次按2.4 g/（kg·d）、3.2 g/（kg·d）、5.7 g/（kg·d）給予補腎方、健脾方和補腎健脾方灌胃。其余各組大鼠灌服等容積的生理鹽水。S組、SD組、PD組、SPD組大鼠采用頭低位-30°尾部懸吊法［3］模擬失重，每天懸吊 24 h，共懸吊 21d；C組大鼠不采取任何處理。實驗第21天，各組大鼠稱重，于灌胃后2 h脫頸椎處死，取第4腰椎（L4）。

1.2.2 指標測定

1.2.2.1 腰椎重量測定 除凈附在第4腰椎上的肌肉和軟組織，在分析天平上稱量重量，計算大鼠L4椎體占體重比（mg/g）。1.2.2.2 骨密度測定 每組中隨機選取6只大鼠的L4椎體，生理鹽水沖洗，用雙能X線骨密度分析儀測定大鼠離體L4椎體的骨密度，以單位面積的骨礦物質(zhì)含量（g/cm2）表示骨密度值。

1.2.2.3 骨形態(tài)計量學參數(shù)測定 每組中剩余6只大鼠的L4椎體，用10%中性甲醛固定，70%～95%酒精梯度脫水，塑料液浸泡，塑料包埋，用硬組織切片機切片，厚度30 μm，麗春紅三色染色，用全自動顯微鏡在50倍視野下進行圖像采集，取切片中心部的5個視野測量并取其平均數(shù)，Image Pro Plus6.0軟件測量骨小梁面積比（Tb.Ar）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨小梁分離度（Tb.Sp）。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 補腎、健脾、補腎健脾三方對模擬失重大鼠L4椎體重量的作用

結(jié)果見表1。

表1 補腎、健脾、補腎健脾三方對模擬失重大鼠L4椎體重量的作用 （±s）

表1 補腎、健脾、補腎健脾三方對模擬失重大鼠L4椎體重量的作用 （±s）

注：與正常組比較，1）P<0.01；與懸吊組比較，2）P<0.01；與補腎健脾組比較，3）P<0.05

組別正常組（C）懸吊組（S）補腎組（SD）健脾組（PD）補腎健脾組（SPD）n 12121212 12 L4重/體重（mg/g）1.307±0.0331.168±0.0431）1.251±0.0472）1.221 ±0.0542）3）1.266±0.0492）

由表1可以看出，與C組比較，S組大鼠L4椎體重/體重明顯降低（P<0.01）；與 S組比較，SD、PD、SPD 組大鼠 L4椎體重/體重均明顯升高（P<0.01）；與SPD組比較，PD組大鼠 L4椎體重/體重降低（P<0.05）。

2.2 補腎、健脾、補腎健脾三方對模擬失重大鼠L4椎體骨密度的作用

結(jié)果見表2。

表2 補腎、健脾、補腎健脾三方對模擬失重大鼠L4椎骨密度的作用 （±s）

表2 補腎、健脾、補腎健脾三方對模擬失重大鼠L4椎骨密度的作用 （±s）

注：與正常組比較，1）P<0.01；與懸吊組比較，2）P<0.05，3）P<0.01；與補腎健脾組比較，4）P<0.05，5）P<0.01

組別 n 骨密度（g/cm2）正常組（C） 6 0.106±0.007懸吊組（S） 6 0.083±0.0031）補腎組（SD） 6 0.093±0.0043）4）健脾組（PD） 6 0.090±0.0082）5）補腎健脾組（SPD） 6 0.100±0.0073）

由表2可以看出，與C組比較，S組大鼠L4椎體骨密度明顯降低（P<0.01）；與S組比較，SD、SPD組大鼠L4椎體骨密度明顯升高（P<0.01），PD組大鼠L4椎體骨密度升高（P<0.05）；與SPD組比較，PD組大鼠L4椎體骨密度明顯降低（P<0.01）、SD 組降低（P<0.05）。

2.3 補腎、健脾、補腎健脾三方對模擬失重大鼠L4椎體骨形態(tài)計量學參數(shù)的作用

結(jié)果見表3和圖1。

表3 補腎、健脾、補腎健脾三方對模擬失重大鼠L4椎體骨形態(tài)計量學參數(shù)的作用 （±s）

表3 補腎、健脾、補腎健脾三方對模擬失重大鼠L4椎體骨形態(tài)計量學參數(shù)的作用 （±s）

注：與正常組比較，1）P<0.01；與懸吊組比較，2）P<0.05，3）P<0.01；與補腎健脾組比較，4）P<0.05，5）P<0.01

組別nTb.Ar（%）Tb.Th（μm）Tb.N（mm）Tb.Sp（μm）正常組（C） 642.55±6.36 54.34±5.92 4.11±0.3093.52±8.86懸吊組（S） 621.49±5.191） 33.19±3.391） 2.89±0.501）132.07±9.501）補腎組（SD） 632.59±5.033）4）43.50±5.653）4） 3.54±0.353） 115.23±10.993）4）健脾組（PD） 631.44±4.643）4）41.86±4.643）5） 3.44±0.392） 117.39±9.732）4）補腎健脾組（SPD） 639.11±4.673） 49.85±3.333） 3.81±0.413）103.37±9.553）

由表3可以看出，與C組比較，S組大鼠L4椎體Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N 均顯著降低（P<0.01），Tb.Sp顯著升高（P<0.01）；與 S 組比較，SD、SPD 組大鼠 L4椎體 Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N均顯著升高（P<0.01），Tb.Sp明顯降低（P<0.01），PD 組大鼠L4椎體 Tb.Ar、Tb.Th明顯升高（P<0.01），Tb.N 增加、Tb.Sp降低（P<0.05）；與SPD組比較，SD和PD組大鼠L4椎體Tb.Ar下降（P<0.05），SD組大鼠L4椎體Tb.Th降低、Tb.Sp升高（P<0.05），PD組大鼠L4椎體Tb.Th明顯降低（P<0.01），Tb.Sp 升高（P<0.05）。

3 討論

實踐證明，人類在進入太空失重環(huán)境后，會出現(xiàn)骨質(zhì)丟失，導致骨密度下降和骨質(zhì)疏松。太空飛行一個月導致骨密度下降約1%～1.5%，這些骨質(zhì)丟失主要發(fā)生于某些特定部位，如腰椎、股骨頸、股骨大轉(zhuǎn)子和骨盆，其程度較絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松更為嚴重［4］。為了提高航天員飛行中的工作能力和返回地面后的再適應(yīng)能力，必須采取有效的防護措施。本研究所采用的大鼠尾部懸吊模型，是目前國內(nèi)外公認的研究模擬失重常用的地面動物模型［3］。實驗結(jié)果顯示，大鼠尾部懸吊21 d L4椎體骨密度顯著下降，骨形態(tài)計量學靜態(tài)參數(shù)改變：骨小梁面積百分率、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量明顯降低，骨小梁分離度明顯增高，L4椎體與體重之比也明顯下降，與以往的研究結(jié)果一致［5］，表明大鼠尾部懸吊21 d出現(xiàn)了明顯的骨質(zhì)疏松。

失重引起的骨丟失是古代中醫(yī)學從未涉及的病癥，是現(xiàn)代人在探索未知世界面臨的一項亟待解決的醫(yī)學課題。但是中醫(yī)學對“骨”的生理有相關(guān)記載，如“腎主骨，脾主四肢”、“脾主運化，充養(yǎng)腎精，精生髓，髓養(yǎng)骨”。因此對失重性骨丟失可以采取補腎方藥、健脾方藥或者補腎健脾方藥進行防治。目前的研究主要集中在對單純補腎和以補腎為主結(jié)合健脾、活血法組方的兩大類方劑的防治效用方面［6-8］，尚未有關(guān)于補腎、健脾、補腎健脾方藥的比較研究。本次實驗發(fā)現(xiàn)，補腎、健脾、補腎健脾三種方藥均在不同程度上升高模擬失重大鼠L4椎體骨密度、L4椎體與體重比，增加L4椎體骨小梁面積百分率、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量，降低骨小梁分離度。韓艷等［9］的研究結(jié)果也顯示益腎中藥復方能顯著改善尾部懸吊大鼠股骨直徑和密度，與本次研究部分結(jié)果一致。本實驗還發(fā)現(xiàn)，在三種方藥中，補腎健脾方藥的作用與補腎方藥和健脾方藥存在差異，其對失重性骨丟失的防護作用為最優(yōu)，而補腎方藥與健脾方藥之間比較差異無統(tǒng)意義，提示健脾方藥可以用于失重性骨丟失的防治，而且對補腎方藥的防治療效具有協(xié)同促進作用。

［1］Smith S M，Wastney M E，O’Brien K O，et al.Bone markers，calcium metabolism，and calcium kinetics during extended-duration space flight on the Mir space station［J］.J Bone Miner Res，2005，20（2）：208-218.

［2］Sibonga J D，Cavanagh P R，Lang T F，et al.Adaptation of the skeletal system during long-duration spaceflight［J］.Clinic Rev Bone Miner Metabol，2008，5（4）：249-261.

［3］Morey-Holton E R，Globus R K.Hindlimb unloading rodent model：technical aspects［J］.J Appl Physiol，2002，92（4）：1367-1377.

［4］Globus R K，Morey-Holton E R.Advances in understanding the skeletal biology of spaceflight［J］.Gravitational and Space Biology，2009，22（2）：3-12.

［5］Tavella S，Ruggiu A，Giuliani A，et al.Bone turnover in wild type and pleiotrophin-transgenic mice housed for three months in the international space station（ISS）［J］.Plos One，2012，7（3）：1-14.

［6］傅騫，胡素敏，周鵬，等.尾部懸吊3周及中藥干預對模擬失重大鼠全身骨密度的影響［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2010，17（1）：28-30.

［7］鄒本貴，劉宏奇.健脾中藥對骨質(zhì)疏松癥大鼠骨組織形態(tài)的改善作用［J］.山西中醫(yī)學院學報，2009，10（1）：11-13.

［8］馬永潔，萬玉民，謝力勤，等.復方活血補腎中藥對尾懸吊大鼠骨質(zhì)量的影響［J］.中國臨床康復，2006，10（3）：133-135.

［9］韓艷，覃華，劉新友，等.益腎中藥復方對模擬失重大鼠股骨生物力學特性的影響［J］.第四軍醫(yī)大學學報，2007，28（11）：1018-1020.