陳繼蘭，黃秀深，曾躍琴，秦玉花，周艷霞

（成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川成都611137）

濕困脾胃證，又稱濕阻中焦證，是指濕邪困阻脾胃，阻遏氣機(jī)所表現(xiàn)出的一組證候。臨床主要表現(xiàn)為頭重身困肢倦，脘悶腹脹，大便溏泄，舌苔白厚而膩，脈濡緩。本研究模擬中醫(yī)發(fā)生濕困脾胃證的三大病因，“久居濕地，飲食不節(jié)，情志不遂”，采用增加濕度、飲食調(diào)控結(jié)合睡眠控制的方法建立大鼠濕困脾胃證動(dòng)物模型［1］，并以此為平臺(tái)，研究其腸屏障能量代謝變化情況，進(jìn)一步探究濕困脾胃證模型大鼠腸屏障功能障礙情況及平胃散的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠40只，雌雄各半，體重180 g～220 g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，檢疫后備用。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，自由攝食全價(jià)顆粒飼料，動(dòng)物房溫度維持在18℃～25℃左右。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 造模用藥：成都人人樂超市購買的熟豬油，自制4℃冰水。治療用藥：平胃散，配方：蒼術(shù)24 g，厚樸18 g，陳皮12 g，炙甘草6 g，均購自同仁堂成都分店，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)制劑室鑒定合格。先將藥物加水500 mL浸泡1 h，然后與大棗2枚、生姜2片一同煎煮至300 mL左右，再濃縮成濃度為1 g生藥/mL藥液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 谷氨酰胺（Gln）測試盒，批號(hào)：20070628；ATPase（定磷法）測試盒，批號(hào)：20070629；考馬斯亮藍(lán)測試盒，批號(hào)：20070714，均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模及給藥 SD大鼠40只，雌雄各半。隨機(jī)分為2批，10只常規(guī)飼養(yǎng)（空白組），30只造模。濕困脾胃模型造模方法：使大鼠居住在溫度18℃～25℃，濕度90%以上的造模箱內(nèi)，每日上午用小站臺(tái)法控制睡眠時(shí)間5 h，單日禁食并給予4℃冰水灌胃1次（1 mL/只），雙日供應(yīng)充足飼料并給予豬油灌胃1次（4 mL/只），連續(xù)20 d。造模結(jié)束后，30只大鼠隨機(jī)分為模型組、平胃散組和自然恢復(fù)組。平胃散組大鼠給予平胃散湯劑灌胃（10 mL/kg），空白組、模型組和自然恢復(fù)組給予等量0.9%生理鹽水灌胃，共3 d。

1.2.2 檢測方法 模型組于造模結(jié)束當(dāng)日處死取材，其他3組3 d后處死取材。冰上取空腸組織各100 mg，冰水勻漿配制成10%勻漿液。待檢測樣品處理方法：Gln：4℃3000 r/min，離心10 min取上清液，-80℃冰凍保存待測；ATPase：4℃ 1500 r/min，離心 15 min取上清液，-80 ℃冰凍保存待測；考馬斯亮藍(lán)測定蛋白含量：4℃1500 r/min，離心10 min取上清液，-80℃冰凍保存待測。檢測操作及運(yùn)算嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)說明書步驟進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)資料中的數(shù)據(jù)采用SPSS11.0 for Windows統(tǒng)計(jì)分析軟件分析處理，數(shù)據(jù)用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物一般狀態(tài)觀察

空白組大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，自始至終形體肥壯，食量較多，活動(dòng)靈敏，背毛光澤，尾色正常，未見大便溏瀉。模型組大鼠反應(yīng)遲鈍，體重減輕，嗜臥懶動(dòng)，皮毛色澤晦暗，毛發(fā)打結(jié)，尾色蒼白無澤，大便溏，飲水量明顯減少。給藥后，平胃散組大鼠體征有所改善，自然恢復(fù)組大鼠體征改善不明顯。

2.2 空腸Gln含量變化

結(jié)果見表1。

表1 空腸Gln變化比較 （±s）

表1 空腸Gln變化比較 （±s）

注：與空白組比較，1）P<0.01；與模型組比較，2）P<0.05，3）P<0.01

組別 n 空腸G l n（m m o l/L）空白組 10 3.6065±1.6080 3）模型組 10 1.1114±0.4579 1）平胃散組 10 2.0519±0.6252 1）2）自然恢復(fù)組 10 1.3243±0.6525 1）

由表1可知，與模型組比較，平胃散組空腸Gln濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 空腸 Na＋-K＋-ATPase、Ga2＋-ATPase 活力變化比較

結(jié)果見表2。

表2 空腸 Na＋-K＋-ATPase、Ga2＋-ATPase 活力變化比較 （±s）

表2 空腸 Na＋-K＋-ATPase、Ga2＋-ATPase 活力變化比較 （±s）

注：與模型組比較，1）P<0.05；與空白組比較，2）P<0.01

空腸 G a 2＋-A T P a s e 活力（m m o l P i/m g·h）空白組 10 3.1101±1.0326 2.6877±1.3768模型組 10 1.7317±0.2791 2） 1.3803±0.3202 2）平胃散組 10 2.4577±0.6859 2.0826±0.5079自然恢復(fù)組 10 1.7186±0.5614 1.7628±0.6975 1）組別 n 空腸N a＋-K＋-A T P a s e活力（m m o l P i/m g·h）

由表2可知，與空白組比較，模型組大鼠空腸Na＋-K＋-ATPase、Ga2＋-ATPase活力顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；Na＋-K＋-ATPase 活 力 自 然 狀 態(tài) 下 未 恢 復(fù) ，Ga2＋-ATPase活力自然狀態(tài)下有一定恢復(fù)，經(jīng)平胃散治療后均有一定好轉(zhuǎn)。

3 討論

3.1 濕困脾胃證與Gln水平的探討

目前認(rèn)為，Gln是腸黏膜屏障中一個(gè)非常重要的營養(yǎng)素，它是腸上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的重要代謝燃料，腸道70%以上的能量供給依賴Gln。Gln參與三羧酸循環(huán)，葡萄糖氧化生成ATP供能，是腸道相關(guān)淋巴組織細(xì)胞和其他各種免疫細(xì)胞中核酸、蛋白質(zhì)等生物分子合成的主要供氮體和氧化供能底物［2］。眾多研究表明，Gln能夠增加腸黏膜厚度，上皮細(xì)胞絨毛長度及縮小緊密連接間隙，維護(hù)腸黏膜結(jié)構(gòu)；提高中性粒細(xì)胞的殺菌能力及SIgA水平，增強(qiáng)腸黏膜免疫功能，增加黏膜含氮量，減少腸道細(xì)菌和內(nèi)毒素移位，從而提高腸黏膜的通透性，維持腸黏膜功能的完整［3］。同時(shí)，Gln也是谷胱甘肽生物合成的前體，有利于還原型谷胱甘肽的儲(chǔ)存；谷胱甘肽又是細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成部分，因此Gln對(duì)清除機(jī)體自由基堆積也有間接作用［3］。臨床上，Gln已作為治療腸黏膜屏障損傷的最重要療法—腸內(nèi)營養(yǎng)的首選營養(yǎng)劑［4］。

本實(shí)驗(yàn)中，模型大鼠Gln含量明顯下降，說明濕困脾胃證導(dǎo)致腸道多種細(xì)胞供能嚴(yán)重不足，腸上皮細(xì)胞供能不足，導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞絨毛變短，緊密連接間隙增大，腸黏膜萎縮，腸道通透性增加，腸黏膜機(jī)械屏障損傷；免疫細(xì)胞供能不足，SIgA分泌減少，免疫功能下降，腸免疫屏障功能障礙；Gln不足導(dǎo)致谷胱甘肽合成減少，自由基清除不利，加速腸黏膜屏障損傷。自然恢復(fù)下大鼠Gln水平難以恢復(fù)，給予平胃散治療后，Gln水平有較好恢復(fù)，提示平胃散可能通過提高機(jī)體Gln水平來修復(fù)損傷的腸黏膜屏障。

3.2 濕困脾胃證與ATPase活性的探討

ATPase主要存在于組織細(xì)胞及細(xì)胞器的膜上，是生物膜上的蛋白酶，它在水液代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、能量轉(zhuǎn)換以及信息傳遞方面發(fā)揮重要作用，維持細(xì)胞內(nèi)外水、電解質(zhì)平衡，維持細(xì)胞的興奮性和傳導(dǎo)性，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及代謝。在腸道，Na＋-K＋-ATPase主要分布于質(zhì)膜上，通過細(xì)胞內(nèi)Na＋和細(xì)胞外K＋的跨膜主動(dòng)交換，使細(xì)胞外與細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生 Na＋濃度梯度，然后通過膜上Na＋、Ga2＋交換器將胞漿中Ga2＋排出胞外，維持腸道平滑肌細(xì)胞正常膜電位和生理功能［5］。Ca2＋-ATPase在腸道平滑肌電生理中發(fā)揮重要作用，Ga2＋是胃腸起搏細(xì)胞Cajal間質(zhì)細(xì)胞（Interstitial Cells of Cajal，ICC）重要且必需的離子基礎(chǔ)，ICC 主要依靠 Ga2＋攜帶內(nèi)向瞬時(shí)電流形成電位差起搏腸道平滑?。?］。

筆者在以前的研究中即發(fā)現(xiàn)，濕困脾胃證大鼠紅細(xì)胞膜、肝細(xì)胞、結(jié)腸組織、腦組織 Na＋-K＋-ATPase 活性降低，平胃散均可糾正這種異常。結(jié)合本次研究中造模大鼠空腸組織 Na＋-K＋-ATPase、Ga2＋-ATPase 活力均明顯下降，提示多系統(tǒng)ATPase活性下降是濕困脾胃證的基本病理改變之一。其損傷機(jī)制可能如下：Na＋-K＋-ATPase受到抑制，細(xì)胞內(nèi) Na＋增多-Na＋、Ga2＋交換增加-細(xì)胞內(nèi) Ga2＋堆積，松解緊密連接及提高腸上皮通透性，并激活特異的鈣依賴的磷脂酶和蛋白酶，引起細(xì)胞損傷和死亡；細(xì)胞外Na＋、Ga2＋濃度降低，ICC自發(fā)電生理活動(dòng)被抑止，腸蠕動(dòng)減慢；ATPase代謝障礙，降解為次黃嘌呤，繼而被黃嘌呤氧化酶催化為黃嘌呤在組織中聚積，產(chǎn)生大量自由基損傷細(xì)胞［7］。在這三重打擊下，腸黏膜機(jī)械屏障功能及完整性均遭到破壞，Na＋腸道吸收障礙，細(xì)胞外液Na＋濃度繼續(xù)降低，導(dǎo)致低鈉血癥發(fā)生，臨床上低鈉血癥可見患者無口渴感，飲水減少，少尿或凹陷性水腫，這與濕困脾胃證主癥較為相似。給予平胃散治療后，二酶活性均有較好恢復(fù)，效果好于自然恢復(fù)組，提示復(fù)方平胃散可能是通過提高組織ATPase活性來修復(fù)細(xì)胞紊亂的能量及水液代謝，發(fā)揮燥濕健脾之效。

［1］劉偉，黃秀深，羅玉熙，等.濕阻證動(dòng)物模型研究進(jìn)展［J］.四川中醫(yī)，2005，24（4）：35-36.

［2］Domeneghini C，Di Giancamillo A，Bosi G，et al.Can nutraceuticals affect the structure of intestinal mucosa？Qualitative and quantitative microanatomy in L-glutamine diet-supplemented weaning piglets［J］.Vet Res Commun，2006，30（3）：331，42.

［3］秦環(huán)龍，沈通一.谷氨酰胺在腸道屏障功能障礙中的作用［M］//王興鵬.腸道屏障功能障礙：基礎(chǔ)與臨床.上海：第二軍醫(yī)大學(xué)出版社，2006：444-451.

［4］Coeffier M，Dechelotte P.The role of glutamine in intensive care unit patients：mechanisms of action and clinical outcome［J］.Nutr Rev.2005，63（2）：65，9.

［5］吳麗穎，王興鵬.腸黏膜內(nèi)pH值及其氧代謝［M］//王興鵬.腸道屏障功能障礙：基礎(chǔ)與臨床.上海：第二軍醫(yī)大學(xué)出版社，2006：173-174.

［6］謝勇，周南進(jìn).Cajal細(xì)胞［M］//王興鵬.腸道屏障功能障礙：基礎(chǔ)與臨床.上海：第二軍醫(yī)大學(xué)出版社，2006：95-96.

［7］王宏志，劉俊，宋慧，等.烏司他丁聯(lián)合三七總皂甙對(duì)急性胰腺炎大鼠氧自由基的影響［J］.世界華人消化雜志，2007，15（17）：1956-1959.