王雨秾，吳春嵐，孫敏梓

（上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海201203）

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是遺傳-環(huán)境-代謝相關(guān)性疾病，包括單純性脂肪肝及由其進(jìn)展而來(lái)的脂肪性肝炎和脂肪性肝硬化。NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但較為公認(rèn)的機(jī)制為以氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化為軸心的“二次打擊學(xué)說”，認(rèn)為初次打擊主要為胰島素抵抗（insulin resistant，IR），二次打擊主要為反應(yīng)性氧化代謝產(chǎn)物增多，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而引起脂肪變性的肝細(xì)胞發(fā)生炎癥、壞死甚至纖維化。IR貫穿NAFLD發(fā)病始終，是造成NAFLD脂質(zhì)代謝紊亂的關(guān)鍵。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素具有增加胰島素敏感性、抗炎、增加葡萄糖攝取、促進(jìn)脂肪酸氧化等作用，并且可以介導(dǎo)肝內(nèi)脂肪變化。因此，通過調(diào)控脂聯(lián)素水平來(lái)改善IR，正成為調(diào)節(jié)NAFLD脂質(zhì)代謝水平的新切入點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wister雄性大鼠60只體重170 g左右，來(lái)源于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可號(hào)：SCXK（滬）2008-0016。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 人參皂苷Re，批號(hào)：0609，7000 mg，純度：90%，吉林大學(xué)有機(jī)教研室；丹參酮IIA標(biāo)準(zhǔn)品1200mg，純度：98%，上海順勃生物技術(shù)有限公司；辛伐他汀，批號(hào)：09475，規(guī)格：20 mg/片×6盒，杭州默沙東制藥有限公司。

1.1.3 高脂飼料的配方 本課題采用Professor Edward W.Kraegen實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期運(yùn)用的大鼠高脂飼料誘導(dǎo)胰島素抵抗，該飼料中含有脂肪59%，碳水化合物20%，蛋白質(zhì)21%，其余如纖維、維生素、微量元素等的含量與正常飼料相同。

1.1.4 主要試劑 脂聯(lián)素試劑盒T228-10，Groundwork Biotechnology Diagnosticate Ltd.；血糖試紙 ACCU－CHEK，生化試劑，羅氏診斷有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型的誘導(dǎo)和給藥方法 Wister大鼠雄性60只，隨機(jī)分成正常組、高脂組、Re組、Re+丹參酮ⅡA組、丹參酮ⅡA組、對(duì)照組6組，每組10只，籠養(yǎng) 1 w，以適應(yīng)環(huán)境。第2周開始，除正常組外，每組用高脂飼料喂養(yǎng)，自由取食，每只每天18 g，每天給飼料前稱量大鼠體重，記錄。同時(shí)，稱量大鼠吃剩的飼料，記錄。喂養(yǎng)2 w后，開始對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)大鼠進(jìn)行藥物干預(yù)，即：對(duì)照組予辛伐他汀7 mg/（kg·d），人參皂苷Re組予Re 50 mg/（kg·d），丹參酮ⅡA組予丹參酮IIA 5 mg/（kg·d），Re+丹參酮IIA組分別予Re 50 mg/（kg·d）+丹參酮IIA 5 mg/（kg·d），連續(xù)灌胃4 w、給藥期間，各組仍予高脂飼料喂養(yǎng)，自由取食，每天稱量體重，記錄。喂養(yǎng)4 w后采集動(dòng)物血清、皮下脂肪、肝臟、下肢肌肉組織各一份，-70℃保存。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)

1.2.2.1 血清膽固醇、甘油三酯、游離脂肪酸檢測(cè) 所有動(dòng)物血清標(biāo)本經(jīng)離心機(jī)離心，轉(zhuǎn)速4000轉(zhuǎn)/min，時(shí)間4 min，抽取上層血清，采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)甘油三酯（TG）、膽固醇（CHOL）、游離脂肪酸（FFA）含量。

1.2.2.2 血清脂聯(lián)素檢測(cè) 采用ELISA法測(cè)定血清脂聯(lián)素（ADP）濃度。實(shí)驗(yàn)操作完全按試劑盒指示操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有計(jì)量資料采用（±s）進(jìn)行描述，各組間采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠喂養(yǎng)前后的體重變化比較結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠喂養(yǎng)前后體重變化 （g，±s）

表1 各組大鼠喂養(yǎng)前后體重變化 （g，±s）

組別 n 喂養(yǎng)前體重 喂養(yǎng)后體重 體重增加量正常組 10 142.64±5.20 269.09±16.77 126.45±17.15高脂組 10 144.83±2.14 285.33±17.48 140.50±16.69 Re 組 10 140.00±5.33 277.17±18.55 137.17±20.54 Re+丹參酮IIA 組 10 142.50±2.88 278.33±28.42 135.83±26.16丹參酮 IIA 組 10 141.00±6.39 275.67±26.20 134.67±22.88對(duì)照組 10 140.5±5.50 262.17±8.66 121.67±8.55

由表1可以看出，各組間體重增量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），各用藥組均較高脂組體重增加緩慢，中藥有延緩大鼠體重增加的趨勢(shì)，但其體重增量仍高于辛伐他汀給藥組，提示中藥對(duì)IR抵抗的大鼠體重的影響不及西藥辛伐他汀明顯。

2.2 各組大鼠血清甘油三酯（TG）與血清膽固醇（CHOL）含量比較

結(jié)果見表2。由表2可以看出，與對(duì)照組比較，Re組、Re+丹參酮IIA組甘油三酯（TG）、膽固醇（CHOL）含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Re+丹參酮IIA聯(lián)合用藥降低CHOL作用在各藥物干預(yù)組中最明顯，優(yōu)于西藥辛伐他汀。2.3 各組大鼠血清游離脂肪酸（FFA）與血清脂聯(lián)素（ADP）含量比較結(jié)果見表3。

表2 各組大鼠血清甘油三酯與血清膽固醇含量比較 （mmol/L，±s）

表2 各組大鼠血清甘油三酯與血清膽固醇含量比較 （mmol/L，±s）

注：與正常組比較，1）P<0.05；與對(duì)照組比較，2）P<0.05

組別 n 甘油三酯（TG） 膽固醇（CHOL）正常組 10 0.39±0.112） 0.87±0.122）高脂組 10 0.49±0.14 1.04±0.12 Re 組 10 0.45±0.192） 1.09±0.261）Re+丹參酮ⅡA組 10 0.44±0.102） 1.02±0.29丹參酮ⅡA組 10 0.56±0.111） 1.05±0.15對(duì)照組 10 0.64±0.281） 1.18±0.161）

表3 各組大鼠血清游離脂肪酸與血清脂聯(lián)素含量比較 （±s）

表3 各組大鼠血清游離脂肪酸與血清脂聯(lián)素含量比較 （±s）

組別 n FFA（mmol/L） ADP（ng/mL）正常組 10 0.58±0.09 2.11±0.28高脂組 10 0.50±0.26 2.02±0.39 Re組 10 0.63±0.38 1.87±0.19 Re+丹參酮IIA組 10 0.57±0.11 2.06±0.27丹參酮 IIA 組 10 0.72±0.28 1.88±0.22對(duì)照組 10 0.65±0.36 1.91±0.24

由表3可以看出，各組間兩兩比較，F(xiàn)FA差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。但結(jié)合各組均值比較發(fā)現(xiàn)，各藥物干預(yù)組較高脂組FFA均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，提示藥物干預(yù)有促進(jìn)脂肪代謝的作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，Re組FFA水平接近西藥對(duì)照組，Re+丹參酮IIA組FFA水平接近正常組，提示Re單獨(dú)或聯(lián)合用藥均具有促進(jìn)脂肪代謝的作用，且聯(lián)合用藥可起到協(xié)同作用，促進(jìn)脂肪分解趨勢(shì)更顯著。ADP在各組間兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Re組、丹參酮IIA組ADP水平接近對(duì)照組水平，而Re+丹參酮IIA組ADP水平接近正常組，優(yōu)于其他組，提示Re+丹參酮IIA聯(lián)合用藥對(duì)改善高脂飲食誘導(dǎo)的IR模型的ADP水平有一定作用。

3 討論

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一種與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷，目前認(rèn)為脂代謝異常（尤其是 TG）與胰島素抵抗（insulin resistance，IR）所引發(fā)的高游離脂肪酸（FFA）、高胰島素血癥是NAFLD發(fā)病機(jī)制的中心環(huán)節(jié)。NAFLD根據(jù)其在肝臟組織中的脂肪變程度和炎癥情況，可從單純性脂肪肝進(jìn)展成非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH），并進(jìn)而進(jìn)展到肝硬化［1］，并且通過加劇胰島素抵抗而誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化性心腦血管疾病的發(fā)生。

脂聯(lián)素是由Scherer P E等［2］首次發(fā)現(xiàn)脂肪特異性分泌蛋白具有調(diào)節(jié)免疫和機(jī)體代謝的雙重作用，在免疫調(diào)節(jié)的同時(shí)，通過內(nèi)分泌、旁分泌、自分泌的方式調(diào)節(jié)機(jī)體代謝。目前研究發(fā)現(xiàn)的兩種脂聯(lián)素受體，脂聯(lián)素受體1（AdipoR1）主要在骨骼肌中表達(dá)，脂聯(lián)素受體2（AdipoR2）主要在肝臟表達(dá)。脂聯(lián)素須與其相應(yīng)受體結(jié)合后，通過激活A(yù)MP活化的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）［3］及有絲分裂原活化蛋白激酶P38（P38 mitogen-activated protein kinase，P38MAPK）兩個(gè)途徑，引起下游一系列信號(hào)分子的改變，使乙酰輔酶A羧化酶（ACC）和過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferators-activated receptorα，PPARα）磷酸化［4］，通過影響胰島素分泌、調(diào)節(jié)脂類氧化葡萄糖攝取、抑制巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而發(fā)揮降糖、降脂，改善IR等生物學(xué)作用［5-6］；并通過影響肝臟脂肪代謝、周圍組織對(duì)胰島素的敏感性、炎癥因子產(chǎn)生等阻斷對(duì)肝臟的“初次打擊”和“二次打擊”，從而抑制NAFLD的形成和進(jìn)展。

人參皂苷Re能起到自由基陷阱作用，可以保護(hù)所有的未飽和脂肪酸，阻止其被氧化；且對(duì)小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫均有刺激作用，增強(qiáng)免疫功能。研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Re在2型糖尿病鼠模型中具有顯著的抗高血糖活性，其可以顯著改善葡萄糖耐量，同時(shí)可顯著降低血清胰島素水平、體重、攝食量和血膽固醇水平，并增加能量消耗和胰島素引起的糖分配［7］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Re可起到“類胰島素”的作用，并從更深層次上解釋了人參皂苷Re的降糖機(jī)制［8］。丹參酮ⅡA可有效地清除氧自由基［9］，并可使血漿中總膽固醇、甘油三酯［10］和低密度脂蛋白的含量降低，高密度脂蛋白的水平升高，從而起到降血脂的作用［11］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FA濃度伴隨ADP水平提高呈下降趨勢(shì)，同時(shí)血清TG、CHOL隨之也呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢(shì)。其機(jī)制可能與胰島素介導(dǎo)的葡萄糖利用率下降以及脂質(zhì)氧化率增高和游離脂肪酸水平降低有關(guān)。與目前研究提示ADP的激活代謝過程相符合。

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