張均克

（江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430056）

傅氏生化湯的祛瘀生新功用已被臨床醫(yī)生習(xí)用，我們將該方作為一種血管新生誘導(dǎo)劑，在大鼠缺血后肢模型中觀察到其促血管新生效應(yīng)［1］。血管新生是從內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cell，EC）受到刺激而增殖游走開始的，其EC來源于既存的微血管內(nèi)皮細(xì)胞［2］。在正常成人，EC和血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）不進(jìn)行有絲分裂，但在生長發(fā)育、缺血缺氧、炎癥及其他應(yīng)激情況下，可以發(fā)生游走和分裂，從而啟動(dòng)血管新生的一系列過程［3］。而在血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志中，CD34的特異性最高，優(yōu)于內(nèi)皮細(xì)胞的其他標(biāo)記物［4］。因此本研究采用免疫組化SABC法檢測大鼠骨骼肌組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞CD34的表達(dá)水平，用以顯示和計(jì)數(shù)微血管密度，更好地觀察評價(jià)傅氏生化湯促血管新生效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Ⅰ級雄性Wistar大鼠50只，體重約200 g～250 g，購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部。

1.1.2 試劑與儀器 羊抗兔SABC試劑盒（即用型）、DAB顯色試劑盒、兔抗大鼠CD34單克隆抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司。主要實(shí)驗(yàn)儀器有恒冷箱切片機(jī)（LEICA CM1900-Cryostat），CS101-2AB電熱干燥箱，隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱及冰箱等。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 實(shí)驗(yàn)用中藥材全部購自武漢市藥材公司，經(jīng)專業(yè)人員鑒定。為使該方的研究結(jié)果更能切合于現(xiàn)代臨床，故將當(dāng)歸、川芎、桃仁、黑姜、炙甘草，按 6∶2∶1.5∶0.5∶0.5的比例，加水浸泡，按常規(guī)煎煮2次，每次1 h，合并濾液濃縮至適量，加95%酒精，使含醇量達(dá)65%，靜置24 h后，過濾，濾液回收乙醇至盡。加蒸餾水定容使成100%濃度，濾過，灌裝，壓蓋，滅菌備用，此即生化湯口服液（以下簡稱SHT）。依60 kg成人每日1劑原方原量換算出大鼠1 d用量，以此作為中劑量，倍之為大劑量，半之為小劑量。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型復(fù)制與分組給藥 大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)2 w后開始實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物模型制作按照文獻(xiàn)［3-5］方法進(jìn)行。將大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔（50 mg/kg）麻醉后，仰臥位固定，脫毛，消毒，于右腹股溝行縱行切口，暴露和分離股動(dòng)脈，分別結(jié)扎股動(dòng)脈起止端及其分支，切除股動(dòng)脈。將大鼠隨機(jī)分成空白對照組、模型組、生化湯小劑量組（SHTS）、生化湯中劑量組（SHTM）、生化湯大劑量（SHTL）組 5組，每組 10只大鼠。各治療組術(shù)后即開始用生化湯每日定時(shí)灌胃，共灌胃用藥30 d。

1.2.2 標(biāo)本取材及組織切片 實(shí)驗(yàn)第31天取材，將大鼠用7%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3 mL/體重100 g），剪開胸腔暴露心臟，用灌注針頭刺入大鼠心臟左心室，通過心臟灌注0.85%NaCl溶液150 mL，然后以4%多聚甲醛磷酸緩沖液（PB pH 7.3）300 mL灌注固定。然后取手術(shù)后肢的內(nèi)收肌組織一小塊，置上述固定4 h（4℃）后轉(zhuǎn)入25% 蔗糖PB液（4℃）24 h。然后恒冷箱切片：-18℃ 20 μm厚，每隔5片取1張，黏至涂有多聚賴氨酸玻片上，置37℃溫箱烤1 h（防脫片）后置室溫保存。

1.2.3 免疫組織化學(xué)檢測方法 采用抗生物素-生物素-過氧化酶復(fù)合物技術(shù)（avidin biotin peroxidase complex technique，ABC法）。按ABC法常規(guī)步驟操作。在作特異性顯色的同時(shí)，設(shè)陰性替代片和空白對照顯色。結(jié)果判定依據(jù)CD34陽性表達(dá)為棕黃色。具體步驟如下：①純甲醇新鮮配制0.5%H2O2，滴加3%H2O2，室溫浸泡30 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。蒸餾水洗3次。②滴加復(fù)合消化液，室溫，30 s～60 s。蒸餾水洗，2 min×3次。③滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min。甩去多余液體，不洗。④滴加一抗（兔抗大鼠CD34抗體和Actin抗體，工作濃度均為1∶200；抗體均為即用型）置20℃，2 h。0.02 M PBS洗2 min×3次。⑤滴加生物素化山羊抗兔IgG，置20℃～37℃，20 min。0.02 M PBS洗3 min×3次。⑥滴加SABC，置20℃～37℃，20 min。0.02 M PBS洗2 min×4次。⑦DAB顯色，使用DAB顯色試劑盒。⑧蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片。⑨觀察，照相。以正常一抗動(dòng)物血清和緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.2.4 MVD計(jì)數(shù) 微血管密度（microvasscular density，MVD）計(jì)數(shù)參照 Weidner N［6］和孫惠川等［7］方法進(jìn)行。即先用 40倍光鏡掃視整個(gè)切片，尋找高血管密度區(qū)，作為熱點(diǎn)。再在200倍光鏡視野下計(jì)數(shù)熱點(diǎn)區(qū)被抗CD34抗體染成棕黃色的血管數(shù)目。任何染成棕黃染的細(xì)胞或細(xì)胞簇，即使未顯示管狀結(jié)構(gòu)，只要它們和鄰近的微血管、細(xì)胞或其他結(jié)締組織分開，就把它們作為一個(gè)微血管。計(jì)數(shù)3個(gè)200倍視野下的血管數(shù)目，由兩位不知臨床資料的高年病理醫(yī)師采用背對背法分別進(jìn)行，取兩者計(jì)數(shù)的平均值。

1.2.5 圖像分析 對未復(fù)染片采用HPIAS-1000彩色圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行計(jì)算機(jī)圖像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠骨骼肌組織CD34免疫組化染色計(jì)算機(jī)圖像分析 結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠骨骼肌組織CD34免疫組化染色光度比較 （）

表1 各組大鼠骨骼肌組織CD34免疫組化染色光度比較 （）

注：與模型組比較，1）P<0.01；與空白對照組比較，2）P<0.01

?

由表1可見，各組的平均光度和積分光度都較空白對照組有所增加，特別是SHT大劑量組明顯增強(qiáng)。表明大鼠在造模以后CD34抗原的表達(dá)增強(qiáng)。

2.2 各組大鼠骨骼肌組織MVD計(jì)數(shù)比較 結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠骨骼肌組織MVD計(jì)數(shù)比較 （）

表2 各組大鼠骨骼肌組織MVD計(jì)數(shù)比較 （）

注：與模型組比較，1）P＜0.05；與空白對照組比較，2）P＜0.05

?

由表2可見，與模型組比較，SHTM組和SHTL組大鼠骨骼肌組織MVD計(jì)數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 SHTL組大鼠骨骼肌組織免疫組化染色CD34抗原表達(dá)情況

結(jié)果見圖1。由圖1可見，CD34陽性表達(dá)主要定位于毛細(xì)血管壁、肌膜和肌纖維間質(zhì)。

圖1 SHTL組大鼠骨骼肌組織免疫組化染色CD34抗原表達(dá)情況

3 討論

采用免疫組化方法標(biāo)記微血管來反映血管新生并提供有價(jià)值的信息已被大多數(shù)學(xué)者所認(rèn)可。血管新生的免疫組化研究是用針對血管內(nèi)皮細(xì)胞（EC）標(biāo)志物的抗體（抗FⅧ-RA、CD31、CD34等）完成的。1991年，Weidner N 進(jìn)行一項(xiàng)探索性研究，用免疫組化法抗Ⅷ因子相關(guān)抗原（抗FVⅢ-RA）單克隆抗體染色血管內(nèi)皮細(xì)胞膜進(jìn)行標(biāo)記血管記數(shù)。Horak E R［8］等用另一種血管細(xì)胞標(biāo)記物CD31，并與FⅧ-RA比較，認(rèn)為抗 CD31比抗 FVⅢ-RA 敏感。Toi M 等［9］也發(fā)現(xiàn) CD31能染色更多的血管。后來認(rèn)為CD34是較特異和敏感的生長中的血管內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志，并且有較強(qiáng)的可重復(fù)性［10-11］，故本研究采用抗CD34單抗來檢測大鼠骨骼肌組織切片中血管內(nèi)皮細(xì)胞CD34表達(dá)狀況，用以反映血管新生狀況。

CD（cluster of differentiation，CD）是位于細(xì)胞膜上一類分化抗原的總稱，又稱為白細(xì)胞分化抗原，它們是不同譜系（lineage）白細(xì)胞（還包括血小板，血管內(nèi)皮細(xì)胞等）在正常分化成熟的不同階段及活化的過程中出現(xiàn)或消失的細(xì)胞表面標(biāo)記。其化學(xué)本質(zhì)是細(xì)胞膜上的一類蛋白質(zhì)或糖蛋白。CD具有重要的生物學(xué)意義，不僅可作為表面標(biāo)志用于細(xì)胞的鑒定和分離，還廣泛參與細(xì)胞的生長、成熟、分化、發(fā)育、遷移、激活。CD34是一種分子量為105 Kda～120 Kda的糖基化跨膜糖蛋白，表達(dá)于骨髓細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，目前無論是基礎(chǔ)研究還是實(shí)際應(yīng)用中都把CD34作為干細(xì)胞的識(shí)別標(biāo)記。此外，CD34還是黏附分子（adhesion molecule）中白細(xì)胞選擇素的配體，調(diào)控早期造血；又是外周淋巴結(jié)地址素（peripheral node addression，PNAd），介導(dǎo)淋巴細(xì)胞歸巢（homing）［12］。

CD34在毛細(xì)血管及小血管內(nèi)皮細(xì)胞中陽性表達(dá)很穩(wěn)定，被認(rèn)為是目前血管內(nèi)皮細(xì)胞的最可靠標(biāo)記［13］，其突出優(yōu)點(diǎn)是不需向血管內(nèi)灌注填充劑、示蹤劑等物；不受灌注充盈的影響，對毛細(xì)血管無刺激作用；保持了微血管的自然狀態(tài)和管徑大?。晃⒀茱@影效果良好，背景染色淺，血管與周圍組織對比明顯，這對進(jìn)行骨骼肌組織微血管的形態(tài)計(jì)量學(xué)研究十分重要。冰凍切片操作簡便，屬常規(guī)方法，可長期保存；血管不易褪色，便于回顧性研究；方法適用范圍廣，人和動(dòng)物組織均適用，可進(jìn)行連續(xù)切片。本研究采用上述方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠后肢缺血模型建立以后，CD34表達(dá)均有所增強(qiáng)，其微血管密度亦顯著增加，表明后肢缺血以后，啟動(dòng)了血管新生的生理過程，EC的增生加速，作為血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記的CD34抗原的表達(dá)亦相應(yīng)增強(qiáng)。因此模型組及SHT各組均比空白對照組顯著增強(qiáng)，MVD增加。但SHT中劑量和大劑量組更為顯著，顯示出一定量效關(guān)系，表明傅氏生化湯有促血管新生的作用，初步顯示出該方作為一種血管新生誘導(dǎo)劑的潛在意義。

［1］邱幸凡，張六通，張均克，等.祛瘀生新法對大鼠治療性血管新生影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.湖北中醫(yī)雜志，2004，26（2）：6-8.

［2］Plate K H，Breior G，Weich H A，et al.Angiogenesis：molecule and mode［J］.Nature，1992，359（2）：845-848.

［3］張均克，鄧耀祖.血管新生研究進(jìn)展［J］.江漢大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2005，33（2）：90-96.

［4］Kimura H，Nakajima T，Kagawa K，et al.Angiogenesis in hepatocellular cacinoma as evaluated by CD34immunohistochemistry［J］.Liver，1998，18（1）：14-19.

［5］吳人亮，劉紹春.免疫組織化學(xué)技術(shù)及應(yīng)用［M］.5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：31-33.

［6］Weidner N，Semple J P，Welch W R，et al.Tumor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast cacinoma［J］.N Engl J Med，1991，324（1）：1-8.

［7］孫惠川，湯釗猷，李曉明，等.肝癌腫瘤血管密度的研究［J］.上海醫(yī)學(xué)，1999，22（1）：15.

［8］Horak E R，Leek K R，lenk N，et al.Angiogenesis，assessed by platelet/endothelial cell adhesion molecule antibodies as indicaton of node metastases and survival in breast cancer［J］.Lancet，1992，340（8 828）：1 120-1 124.

［9］Toi M，Kashitani J，Tominage T.Tumor angiogenesis is an independent prognostic indicator in primary breast carcinoma［J］.IntJ Cancer，1993，55（3）：371.

［10］Traweek S T，Kandalaft P L，Mehta P，et al.The human hematopoietic progenitor cell antigen（CD34）in vascular neoplasia［J］.Am J Clin Pathol，1991，96（1）：25-31.

［11］Tanigawa N，Lu C，Mitsui T，et al.Quantitation of sinusoidlike vessels in hepatocellular carcinoma：its clinical and prognostic significance［J］.Hepatol，1997，26（5）：1 216-1 223.

［12］龔非力.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)［M］.武漢：武漢科學(xué)出版社，1999：76-98.

［13］Hollingsworth HC，Kohn E C，Steinberg S M，et al.Tumor angiogenesis in advanced stagy ovarian carcinoma［J］.Am J Pathol，1995，147（1）：33-41.