方向明，袁亞美，王麗娜，胡 謙

（安徽中醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230038）

平喘寧為治療臨床寒性哮喘的有效方劑，由射干麻黃湯和三子養(yǎng)親湯化裁而成，功效溫肺化痰、止咳平喘、息風(fēng)止痙，治療寒哮。第二信使cAMP、cGMP可能是陰陽(yáng)學(xué)說的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，多篇文獻(xiàn)報(bào)道cGMP含量升高、cAMP/cGMP比值降低是陽(yáng)虛證的特征，是判斷肺陽(yáng)虛模型復(fù)制成功的指標(biāo)。TGF-β是已知最強(qiáng)的致纖維化因子之一［1］，其功能的發(fā)揮主要取決于TGF-β1。肺組織中的TGF-β1基因表達(dá)強(qiáng)度與膠原的含量成明顯正相關(guān)［2］，并作為TGF家族的多效細(xì)胞因子，在氣道高反應(yīng)性（AHR）與氣道急性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮抑制性作用。但在氣道受到抗原的反復(fù)刺激造成慢性炎癥時(shí)，氣道中的TGF-β1持續(xù)性增高，進(jìn)而引起或促進(jìn)氣道重建和肺組織纖維化［3-4］。該實(shí)驗(yàn)通過平喘寧干預(yù)寒性哮喘大鼠模型，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RTPCR），檢測(cè)哮喘大鼠肺臟的TGF-β1mRNA表達(dá)水平，研究該藥治療寒性哮喘的分子生物學(xué)效應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8月齡健康雄性Wistar大鼠70只，體重200 g～220 g，普通級(jí)，安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK（皖）2011-002。

1.1.2 藥物與試劑 平喘寧方藥組成：麻黃、杏仁、蘇子、半夏等，飲片來源：安徽中醫(yī)學(xué)院國(guó)醫(yī)堂制劑中心，分別煎制成3級(jí)濃度生藥，濃度分別為4.2 g/mL（大劑量）、2.1 g/mL（中劑量）、1.05 g/mL（小劑量）。地塞米松片：上海信誼藥業(yè)有限公司產(chǎn)品（批號(hào)：030402）；桂龍咳喘寧：山西桂龍醫(yī)藥有限公司（批號(hào)：Z20053135）。卵蛋白（OVA）（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：A8040），3%戊巴比妥鈉（德國(guó)Merok公司，批號(hào)：20070923），SP免疫組化染色試劑盒（中山生物技術(shù)有限公司），DAB顯色劑試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega公司），目的基因和GAPDH引物（上海捷瑞生物技術(shù)有限公司），DEPC（美國(guó)Gibico公司），EB（美國(guó)Sigma公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 402AI型魚躍牌超聲霧化器（上海魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司）；CX21型光學(xué)顯微鏡，BX51型熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；DNA擴(kuò)增儀、DU640紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Backman公司）；Eagle EyeⅡ凝膠成像儀（AGENE公司）；DYYⅢ2型電泳儀（北京六一儀器廠）；玻璃勻漿器（中國(guó)科大生物技術(shù)有限公司）；Speetra classic酶標(biāo)分析儀（Austria公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 哮喘模型制備及標(biāo)本采集 將70只大鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組、模型組、地塞米松組［0.4 mg/（kg·d）］、桂龍咳喘寧組［10 g/（kg·d）］，平喘寧低劑量組［4.9 g/（kg·d）］、平喘寧中劑量組［9.8 g/（kg·d）］、平喘寧高劑量組［19.6 g/（kg·d）］7組，每組10只。第1天、第8天采用大鼠腹腔注射100 g/L卵蛋白生理鹽水混懸液1 mL致敏。采用10 g/L卵蛋白溶液超聲霧化20 min～30 min，1次/d，連續(xù)7 d，致大鼠出現(xiàn)點(diǎn)頭、身顫、節(jié)律性收腹樣喘促等現(xiàn)象，提示模型復(fù)制成功。第15天給藥與誘喘同時(shí)進(jìn)行，并給予寒冷刺激，連續(xù)4 w。給藥采用誘喘前30 min灌胃，空白對(duì)照組、模型組每天給予等量蒸餾水灌服。末次激發(fā)1 h后，采用腹腔注射水合氯醛0.35 mL/100 g麻醉大鼠，打開胸腔，取右肺和左肺組織放入凍存管中，置-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 cAMP/cGMP檢測(cè) 按試劑盒說明書進(jìn)行，該試劑盒為酶標(biāo)記免疫吸附測(cè)定法（ELISA）。利用抗原能吸附到固相載體表面的特性，使cAMP、cGMP抗體反應(yīng)在固相載體表面進(jìn)行，分離cAMP、cGMP抗原抗體結(jié)合物，在450 nm波長(zhǎng)的條件下用酶標(biāo)儀獲取吸光度（OD值），并測(cè)算cAMP、cGMP 濃度。

1.2.3 TGF-β1mRNA測(cè)定 根據(jù)cDNA文庫(kù)與相關(guān)文獻(xiàn)［5］，引物由上海捷瑞生物工程有限公司（ISO9001：2008）設(shè)計(jì)合成。TGF-β1擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度：231 bp，F(xiàn)orward primer：5′-TGGTGGACCGCAACAACGCAAT-3′，Reverse primer：5′-TGGGGGTCAGCAGCCGGT TA-3′；GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度：431 bp，F(xiàn)orward primer：5′-GGGGCTCTCTGCTCCTCC CTG-3′，Reverse primer：5′-AGGTGAGCCCCAGCCTTCTCC-3′。取100 mg肺組織放于勻漿管內(nèi)，冰上操作，加入1 mL Trizol溶液，研磨組織后，倒入1.5 mL EP管中，混勻室溫靜置5 min后，每1 mL Trizol溶液中加0.2 mL氯仿，混勻室溫靜置5 min后，15 000 rmp離心15 min。將上層水相轉(zhuǎn)入新的1.5 mL EP管中，加入0.5 mL異丙醇，混勻后置于-20℃1 h。然后12 000 rmp離心10 min，留取沉淀，加入1 mL 75%乙醇，振蕩洗滌RNA沉淀1次，后7 500 rmp離心5 min，小心倒掉上清，置于超凈工作臺(tái)吹干沉淀，再在管中加入20 μL DEPC水溶解完全，即得大鼠肺組織總RNA。取5 μL總RNA點(diǎn)樣于0.8%瓊脂糖凝膠電泳，Eagle EyeⅡ凝膠成像儀觀察電泳條帶，并用DU640紫外分光光度計(jì)測(cè)算RNA260nm/280nm比值。逆轉(zhuǎn)錄（RT）：取2μL總RNA加10mMdNTPMix2μL、Oligo（dT）18primer 1 μL 于 100μL EP 管中，再加 Water，nuclease-free 9 μL，5×Reaction buffer 4 μL、Revert AidTMMMulvReverseTranscriptase1 μL，RiboLockTMRNase Inhibitor 1 μL于反應(yīng)管中，42℃水浴60 min，70℃水浴5 min以失活逆轉(zhuǎn)錄酶終止逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，冰浴冷卻，即得cDNA。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）：先將 TGF-β1、GAPDH 兩對(duì)引物稀釋至濃度為10 pmol。加樣依照如下體系進(jìn)行：cDNA 2 μL，10 pmol Forward primer 1 μL，10 pmol Reverse primer 1 μL，nuclease free water 8.5 μL，PCR Master Mix（2×）12.5 μL，低速離心混勻。反應(yīng)條件：TGF-beta1：變性 40 s，95℃；退火60℃，40 s；72℃延伸，40 s；共進(jìn)行 34個(gè)循環(huán)，最后 72℃延伸7 min，擴(kuò)增長(zhǎng)度片段231 bp。GAPDH：變性 40 s，95℃；退火 60 ℃，40 s；72 ℃延伸，40 s；共進(jìn)行 34個(gè)循環(huán)，最后 72℃延伸7 min，擴(kuò)增長(zhǎng)度片段431 bp。PCR產(chǎn)物電泳分析：分別取5 μL PCR產(chǎn)物與1 μL DNA加樣緩沖液混勻，以1%瓊脂糖凝膠電泳，同時(shí)加100 bp Marker，其結(jié)果用Eagle EyeⅡ凝膠成像儀分析：①確定產(chǎn)物位置；②光密度值掃描（密度代表基因表達(dá)豐度）；③半定量計(jì)算：TGF-β1mRNA表達(dá)豐度/GAPDH表達(dá)豐度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 cAMP/cGMP檢測(cè)結(jié)果

各組大鼠肺組織cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP比值測(cè)算如下，結(jié)果見表1。

表1 大鼠肺組織cAMP、cGMP含量參數(shù)比較 （nmol/L，）

表1 大鼠肺組織cAMP、cGMP含量參數(shù)比較 （nmol/L，）

注：與模型組比較，1）P<0.05，2）P<0.01

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由表1可知，與模型組比較，平喘寧各劑量組肺組cGMP含量降低，cAMP/cGMP升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

2.2 總RNA純度測(cè)定

各組總 RNA 260 nm/280 nm 平均比值為 1.8～2.0［6］，表明總RNA基本無蛋白質(zhì)污染與降解，RNA純度較好。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠肺組織總RNA純度比較

2.3 TGF-β1-mRNA表達(dá)豐度半定量

TGF-β1-mRNA表達(dá)豐度半定量，以GAPDH為內(nèi)參，各組PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳，用Eagle EyeⅡ凝膠成像儀分析。與模型組比較，平喘寧各劑量組PGF-β1-mRNA 表達(dá)率度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見表3，圖1。

表3 各組TGF-β1-mRNA表達(dá)豐度半定量比較 （）

表3 各組TGF-β1-mRNA表達(dá)豐度半定量比較 （）

注：與空白對(duì)照組比較，1）P<0.05，2）P<0.01；與模型組比較，3）P<0.05，4）P<0.01

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3 討論

第二信使cAMP、cGMP可能是陰陽(yáng)學(xué)說的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，具有相互拮抗制約的生物學(xué)效應(yīng)。多家文獻(xiàn)報(bào)道cGMP含量升高、cAMP/cGMP比值下降是陽(yáng)虛證的表現(xiàn)。在肺組織中，cAMP含量上升則舒張支氣管平滑肌，支氣管得以擴(kuò)張；與之相反，cGMP含量上升則收縮支氣管平滑肌，誘發(fā)哮喘［5-7］。該實(shí)驗(yàn)顯示模型組較空白對(duì)照組cGMP含量升高、cAMP/cGMP比值下降（P<0.01）；治療組較模型組cGMP含量降低、cAMP/cGMP比值上升（P<0.01，P<0.05）。證明肺陽(yáng)虛大鼠模型復(fù)制成功，并為平喘寧治療寒性哮喘提供了合理性依據(jù)。

支氣管哮喘是由多種炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及其分泌的炎性介質(zhì)與細(xì)胞因子共同參與的氣道慢性炎癥，支氣管上皮細(xì)胞與氣道平滑肌細(xì)胞（ASMC）也參與了這個(gè)炎癥過程，而氣道重構(gòu)則是慢性哮喘反復(fù)發(fā)作的病理學(xué)基礎(chǔ)，是氣流受限甚至不可逆的主要原因，可加重氣道高反應(yīng)性。氣道上皮下纖維化、ASMC增生與肥大是氣道收縮與重構(gòu)的主要病理基礎(chǔ)。TGF-β1參與激活ERK通路，嗜酸性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等細(xì)胞都可以分泌 TGF-β1［8-9］。TGF-β1結(jié)合胞膜表面受體，激活Ras-Raf-MEK-ERK通路，ERK磷酸化后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，進(jìn)而影響相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞的特異性表達(dá)。TGF-β1在促進(jìn)膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)在肺間質(zhì)和肺泡間沉積與纖維細(xì)胞增殖中起關(guān)鍵作用，因此TGF-β1在哮喘發(fā)病中起重要作用。平喘寧由射干麻黃湯與三子養(yǎng)親湯化裁而成，功效溫肺化痰、止咳平喘、祛風(fēng)解痙，主治寒性哮喘。在實(shí)驗(yàn)過程中，模型組、地塞米松組、平喘寧高、中劑量組各死亡1只大鼠，桂龍咳喘寧組、低劑量組死亡2只大鼠，主要在造模、灌胃給藥過程中，原因可能與大鼠過敏有關(guān)。

該研究顯示平喘寧能夠顯著降低寒性哮喘大鼠肺組織中TGF-β1RNA的表達(dá)水平，從而減輕或逆轉(zhuǎn)氣道重構(gòu)，降低氣流受限程度，這可能即是平喘寧有效治療寒性哮喘的分子機(jī)制之一。

［1］Rajendra R.Role of transformin growth factor-β in repair and fibrosis［J］.Chest，1991，99（3）：61S.

［2］Czaja M J.In vitro and in vivo association of transforming growth factor-β1with hepatic fibrosis［J］.J Cell Biol，1989，108（3）：2 476.

［3］Macao A.Is TGF-betel the key to suppression of human asthma?［J］.Trends Immunol，2001，22（3）：115-118.

［4］Kohan M，BaderR，Puxedduw I，etal.Enhanced osteopontin expression in asthma model of allergen-induced airway remodeling［J］.Clin Exp All，2007，37（10）：1 444-1 454.

［5］McClanahan T，Dairymple S，Barkett M，et al.Hemato poietic growth factor receptor genes as markers of lineage commitment during in vitro development of hematopoietic cells［J］.Blood，1993，181（11）：2 903-2 915.

［6］Sambrook J，Russell D W.Molecular cloning：A laboratory manual［M］.Beijing：Science publishing house，2002：532-544.

［7］Barnes P J.Beta-adrenergic receptors and their regulation［J］.Am J Respir Crit Care Med，1995，152（2）：838-860.

［8］鐘華，何芳，胡清華，等.ERK和Smad通路在TGF-β1抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖中的作用［J］.中國(guó)病理生理雜志，2009，25（9）：1 665-1 670.

［9］McKay S，Jongste J C，Saxena P R，et al.Angiotensin II induces hypertrophy of human airway smooth muscle cells：expression of transcription factors and transforming growth factor-beta1［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，1998，18（6）：823-833.