郭桂明,胡海波,周兆山*,閆云霞

(1.青島大學醫(yī)學院，山東 青島 266021；2.青島市海慈醫(yī)療集團，山東 青島 266033)

哮喘是以氣道炎癥、氣道重塑為特征的變態(tài)反應(yīng)性疾病，多種炎癥細胞和細胞因子參與其發(fā)病，其中IL-10和VEGF在發(fā)病機制中起重要作用，因此備受重視。多年來導師在臨床上以“和解滲利”為治法，擬用柴胡滲濕湯治療哮喘熱哮證，經(jīng)過前期的臨床觀察，發(fā)現(xiàn)其有顯著的療效，且具有見效快、療程短的優(yōu)點。本實驗從細胞分子水平探討柴胡滲濕湯防治哮喘的可能機制，為該方進一步推廣和應(yīng)用提供現(xiàn)代科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 選擇清潔級健康雄性Wistar大鼠84只(購自山東魯抗醫(yī)藥集團有限公司，許可證號為：SCXK魯20110017)，體質(zhì)量(200±20)g，月齡2～3月，在室溫18～22 ℃、濕度28%環(huán)境中飼養(yǎng)，利用自然光線采光，6只1籠，以常規(guī)飼料喂食飼養(yǎng)1周后開始實驗。將84只雄性Wistar大鼠，按隨機數(shù)字表法分為正常對照組、模型對照組、地塞米松組、定喘湯組、柴胡滲濕湯低劑量組、柴胡滲濕湯中劑量組、柴胡滲濕湯高劑量組，每組12只。

1.2 藥物 卵蛋白(OVA)凍干粉10 g/支(Grade Ⅱ sigma公司);地塞米松片(天津天藥藥業(yè)股份有限公司)，磨碎溶于生理鹽水中，制成0.033 mg/mL滅菌用水溶液；定喘湯：白果9 g，麻黃10 g，款冬花10 g，半夏12 g，桑白皮10 g，紫蘇子6 g，黃芩6 g，甘草3 g，杏仁10 g；柴胡滲濕湯：柴胡12 g，黃芩15 g，半夏12 g，黨參15 g，生姜10 g，大棗10 g,甘草6 g，石膏30 g，薏苡仁30 g，石韋15 g，車前草15 g，茯苓10 g，浙貝母15 g。中藥配方由青島市海慈醫(yī)療集團中藥制劑室制成滅菌濃煎密封制劑，定喘湯組生藥含量為0.5 g/mL，柴胡滲濕湯低、中、高劑量組生藥含量分別為0.66、1.320、2.64 g/mL。

1.3 試劑及儀器 大鼠IL-10 ELlSA試劑盒、VEGF ELISA試劑盒(欣博盛生物科技有限公司)；電子天平(Bsl10型，Sartorius公司)；霧化箱(青島市海慈醫(yī)療集團呼吸內(nèi)科自制);超聲霧化器(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn)，上海魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司經(jīng)銷，產(chǎn)品標準號Q/3211812YQ007-2000)；低溫冰箱(中國山東青島)；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(PYX-DHS-X，上海市躍進醫(yī)療器械廠)；酶標儀(Multi skan Ascent V 1.24 345-0063T浙江分析儀器廠)。

1.4 動物模型制備 哮喘模型組和各治療組均于實驗的第1、8、15天共3次在腹腔分2點注射10%卵白蛋白生理鹽水溶液1 mL致敏；第3次致敏1周后，模型組和各治療組動物每日超聲霧化吸入1%卵白蛋白生理鹽水溶液20 min，誘發(fā)其哮喘發(fā)作，直至出現(xiàn)霧化時見大鼠出現(xiàn)打噴嚏、咳嗽、呼吸困難和喘息、大小便失禁、抓耳朵、發(fā)紺等癥狀說明大鼠模型制備成功，連續(xù)激發(fā)21 d。正常對照組予生理鹽水代替抗原進行致敏和激發(fā)。

1.5 給藥方法 各組均從激發(fā)階段的第15天起開始給藥，各組用藥量據(jù)大鼠與人每公斤體質(zhì)量折算系數(shù)計算。地塞米松組用地塞米松片0.5 mg/(kg·d)灌胃，連續(xù)7 d；定喘湯組大鼠需生藥1.27 g/(kg·d)，灌胃，連續(xù)7 d；柴胡滲濕湯低、中、高劑量組，分別需生藥10.15、20.31、40.62 g/(kg·d)灌胃，連續(xù)7 d；正常組和模型組給予生理鹽水灌胃，連續(xù)7 d。

1.6 觀察指標與檢測方法 末次激發(fā)24 h后以10%水合氯醛(1 mU l00 g)腹腔注射麻醉動物，四肢及背部固定，于頸部游離出氣管，打開并暴露胸腔，心臟取血4 mL，再游離出右主支氣管后，于氣管喉軟骨下0.5 cm處切一道“T”形口，將5號采血針(去針頭)置于管腔,達1 cm處，以0號手術(shù)線固定，接5 mL注射器(內(nèi)含3 mL生理鹽水)，緩慢沖洗3次，回收肺泡灌洗液(回吸率在80%以上)。低溫下離心血清和肺泡灌洗液，取上清液,-20 ℃保存。用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清和BALF中IL-10及VEGF的含量，具體操作按照說明書進行。

2 結(jié)果

2.1 實驗后大鼠存活率比較 見表1。

表1 大鼠存活率比較 只

2.2 治療后各組IL-10和VEGF的含量比較

2.1.1 治療后各組大鼠血清IL-10和VEGF的含量比較 見表2。

2.2.2 治療后各組大鼠BALF中IL-10及VEGF的含量比較 見表3。

表2 各組大鼠血清IL-10和VEGF的含量比較±s) pg/mL

表3 各組BALF中IL-10及VEGF的含量比較±s) pg/mL

3 討論

筆者認為，少陽郁結(jié)化火，水濕內(nèi)停是哮喘熱哮證的重要病機。故從和解少陽，滲利水濕入手，提出和解滲利法，擬用柴胡滲濕湯治療哮喘熱哮證，經(jīng)過前期的臨床觀察療效顯著，具有見效快、療程短等優(yōu)點。方中小柴胡湯中柴胡、姜半夏、黃芩、黨參、甘草疏解少陽郁熱，調(diào)理肝膽氣機，恢復少陽樞機；茯苓、薏苡仁、車前草、石韋淡滲利濕，祛除“濕”“水”“飲”邪，疏通行水之道，以絕痰源，并能上清肺熱，利濕同時給熱邪以出路，使肺熱得清；石膏、浙貝母清肺化痰，治療痰熱之標。

IL-10和VEGF在哮喘發(fā)病機制中起重要作用，備受重視。目前研究認為，IL-10是一種抑炎因子，在哮喘發(fā)病機制中具有負調(diào)節(jié)作用[1-4]；VEGF既參與氣道炎癥反應(yīng)又參與氣道重塑。Lee SY等[5]證實，哮喘患者BALF中VEGF表達增高，并認為VEGF表達增高與EOS計數(shù)增高呈正相關(guān)，也有研究表明，哮喘患者在急性發(fā)作時存在呼吸道VEGF表達升高，且與呼吸道炎性反應(yīng)加重有關(guān)。Feltis BN等[6]通過對支氣管黏膜活檢和支氣管肺泡灌洗液的研究，發(fā)現(xiàn)哮喘患者VEGF水平升高，并與上皮下血管化程度相關(guān)，證明VEGF參與微血管重建。且多數(shù)研究[7-9]通過下調(diào)VEGF的表達而抑制哮喘呼吸道重塑的發(fā)生發(fā)展。

從本實驗結(jié)果可知，1)柴胡滲濕湯能有效緩解哮喘大鼠的癥狀表現(xiàn)，抑制氣道炎癥反應(yīng)和氣道重塑，其作用機制與上調(diào)IL-10、下調(diào)VEGF的水平有關(guān)；2)柴胡滲濕湯緩解哮喘大鼠的癥狀、抑制氣道炎癥反應(yīng)和氣道重塑作用優(yōu)于定喘湯；3)柴胡滲濕湯在抑制哮喘模型大鼠的氣道炎癥和氣道重塑中，存在著顯著的量效關(guān)系，即隨著給藥劑量的增加其療效也隨之加強，但是高劑量組病死率較高，可能與藥物劑量過大相關(guān)，還需進一步探討研究。

據(jù)此，在臨床上應(yīng)根據(jù)患者的病情以及體質(zhì)情況，在保證用藥安全的基礎(chǔ)上適當?shù)脑黾咏o藥劑量以提高臨床療效。

[1]張威,李勇紅.IL-4,IL-10與變應(yīng)性哮喘的相關(guān)性研究[J].中華中醫(yī)學雜志,2007,31(1):37-38.

[2]林士軍,王桂杰,董惠翔,等.IL-10,IL-12與支氣管哮喘[J].醫(yī)學綜述,2005,11(5):428-430.

[3]Jeannin P,Lecoanet S,Delneste Y,et al.IgE versus IgG4 production can be differentially regulated by IL-10[J].J Immunol,1998,160(7):3555-3561.

[4]郭胤仕,許以平,邵莉,等.IL-10,TGF-β1,ECP與支氣管哮喘的相關(guān)性研究[J].現(xiàn)代免疫學,2005,25(5):410.

[5]Lee SY,Kwon S,Kim KH,et al.Expression of vascular endothelial growth factor and hypoxia-inducible factor in the airway of asthmatic patients[J].Ann Allergy Asthma Immunol,2006,97(6):794-799.

[6]Feltis BN,Wignarajah D,Zheng L,et al.Increased vascular endothelial growth factor and receptors:relationship to angiogenesis in asthma[J].Am J Respir Crit Care Med,2006,173(11):1201-1207.

[7]Feltis BN,Wignarajah D,Reid DW,et al.Effects of inhaled fluticasone on angiogenesis and vascular endothelial growth factor in asthma[J].Thorax,2007,62(4):314-319.

[8]Wang K,Liu CT,Wu YH,et al.Budesonide/formoterol decreases expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and VEGF receptor 1 within airway remodelling in asthma[J].Adv Ther,2008,25(4):342-354.

[9]Kanazawa H,Tochino Y,Ichimaru Y,et al.Role of vascular endothelial growth factor in pulmonary endothelial cell injury by exercise challenge in asthmatic patients[J].J Asthma,2006,43(4):267-271.