張小卿 陶冶 田國偉 吳景東

[摘要]目的：研究針刺對于照射引起的皮膚光老化大鼠皮膚組織中超氧化物歧化酶(s0D)、丙二醛(MDA)的含量及谷胱甘肽氧化酶(GSH-Px)活性的影響，探討針刺對抗皮膚光老化的作用。方法：將大鼠隨機(jī)分成4組，除正常組外，其余各組模擬日光中uv(uVA+UVB)照射，造成皮膚光老化模型。每次造模前，針刺組給予電針刺激，陽性對照組采用VE涂抹造模部位，15周后對比各組生化指標(biāo)結(jié)果。結(jié)果：模型組與正常組比較大鼠皮膚組織中SOD、GSH-Px活性明顯降低，MDA含量明顯增加(P<0.05)；針刺組與模型組比較SOD、GSH-Px活性增加，MDA含量明顯降低(P0.05)。結(jié)論：針刺可對抗uv引起的皮膚光老化，其機(jī)理可能是通過增強(qiáng)皮膚中SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量來改變皮膚的老化外觀的。

[關(guān)鍵詞]針刺；光老化；超氧化物歧化酶；丙二醛；谷胱甘肽氧化酶

[中圖分類號]Q591.3[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1 008-6455(2012)07-1168-03

皮膚光老化是源于紫外線(UV)損害，在光暴露部位的皮膚提早出現(xiàn)皺紋，并伴有皮膚干燥、粗糙、皮革樣外觀、毛細(xì)血管擴(kuò)張、色素異常沉著、甚至癌變等?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》中說：“十二經(jīng)脈，三百六十五絡(luò)，其氣血皆上于面而走空竅?！贬樉膶植科つw、穴位的刺激及對臟腑氣血的調(diào)攝，在防止皮膚皺紋產(chǎn)生，延緩皮膚衰老方面有確切療效。由于自由基損傷與衰老密切相關(guān)，故本實驗以UV致大鼠皮膚光老化為研究對象，觀察針刺對皮膚組織中自由基及各類酶活性變化的影響，旨在初步探討針刺防治皮膚老化的作用機(jī)理，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料和方法

1.1實驗動物與分組方法：健康雄性SD大鼠40只，體重(220±25)g，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為正常組、模型組、針刺組、VE組。各組每5只放入一籠飼養(yǎng)，常規(guī)飼食和飲水，無不良因素影響，在相同的自然環(huán)境下飼養(yǎng)1周，待其適應(yīng)實驗室環(huán)境后開始進(jìn)行實驗。

1.2主要試劑及設(shè)備：自制紫外線燈箱(40WUVB燈管4根，光譜集中在297nm；40WUVA燈管2根光譜集中在365nm)，uv輻照計(臺灣路昌)，6805D電針儀，勁霸電推剪；SOD試劑盒、MDA試劑盒、GSH-Px試劑盒(南京建成生物有限公司)；維生素E膠丸(天海藥業(yè))：-70℃冰箱、勻漿器、離心機(jī)、恒溫水浴箱、分光光度計均由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗教學(xué)中心提供。

1.3實驗方法：模型組大鼠不予任何治療。針刺組大鼠在密封罐中用乙醚麻醉，昏迷后取出在大鼠固定架上捆綁，以28號0.5寸毫針針刺大鼠雙側(cè)“脾俞”、“腎俞”、“足三里”穴，直刺8mm，疏密波，刺激時間20min，以大鼠肢體或針柄微微顫動為度，每日一次，于針刺后30min開始造模。VE組大鼠于造模前30min，在背部剪毛區(qū)域內(nèi)涂抹VE后造模。

1.4造模方法：參考楊汝斌SD大鼠皮膚光老化動物模型劑量及方法，每只大鼠均用電推剪剪除大鼠背部5.0cm×5.0cm區(qū)域內(nèi)毛發(fā)，以后每次照射前用剃須刀剃除該部位的毛發(fā)。動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，第2周開始將模型組、針刺組、VE組大鼠放入自制照射箱中，并置于距離光源30cm處的水平面上，第2周每天照射2h，第3～7周每天照射4h，第8～12周每天照射6h，照射以5天為一個周期，間隔2天，再開始下一個周期。至13周時終止UV暴露(UVA照射強(qiáng)度累計為148.47J／cm²，UVB輻照強(qiáng)度累計為48.67J／cm²)，繼續(xù)觀察1周。造模過程中每天觀察動物背部皮膚有無水皰及糜爛等，如果出現(xiàn)上述癥狀，立即停止照射2～3天，至上述癥狀消失后再繼續(xù)照射，直至造模成功。

1.5取材：15周將各組大鼠斷頸處死，迅速取背部光老化處皮膚組織全層，保存于-70℃冰箱中待測。

1.6生化指標(biāo)測量：紫外分光光度計分別測定各組大鼠皮膚組織中SOD、GSH-Px活性及MDA的含量。各項指標(biāo)的測定均按照試劑盒說明書進(jìn)行測定，采用化學(xué)比色法。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法：本實驗數(shù)據(jù)采用SPSS(16.0)軟件，運(yùn)用多個樣本均數(shù)比較的方差分析檢驗，數(shù)據(jù)以x±s表示，并用最小顯著差法(LSD法)作兩兩比較。

2結(jié)果與分析

2.1各組大鼠皮膚組織中SOD活性比較：從表l可見，模型組大鼠皮膚組織中SOD活性明顯降低，與正常組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而針刺組和VE組SOD活性分別與正常組和模型組比較均有差異(P<0.05)，提示針刺和局部外涂維生素E均能提升光老化大鼠皮膚組織中SOD活力，具有抗皮膚光老化作用，但是與正常大鼠比較還有差異。

2.2各組大鼠皮膚組織中MDA含量比較：模型組大鼠皮膚組織中MDA含量增加，與正常組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；針刺組、VE組MDA含量和模型組比較有差異(P<0.05)，而針刺組與正常組比較無差異(P>0.05)。提示針刺降低光老化大鼠皮膚組織MDA含量療效顯著。

2.3各組大鼠皮膚組織中GSH-Px活力比較：模型組大鼠皮膚組織中GSH-Px活力明顯降低，與正常組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)：而針刺組和VE組GSH-Px活力分別與正常組和模型組比較均有差異(P<0.05)，提示針刺和局部外涂維生素E在一定程度上可以提升光老化大鼠皮膚組織GSH-Px活力，二者療效相似。

3討論

皮膚光老化是指由于長期的日光照射導(dǎo)致皮膚衰老或加速衰老的現(xiàn)象。人們通常把由于遺傳及不可抗拒的因素(如地心引力、機(jī)體重要器官的生理功能減退等)引起的皮膚內(nèi)在性衰老稱為自然老化，把由于環(huán)境因素如紫外輻射、吸煙、風(fēng)吹及接觸有害化學(xué)物質(zhì)引起的皮膚衰老稱為外源性老化。由于日光中紫外輻射是環(huán)境因素中導(dǎo)致皮膚老化的主要因素，所以通常所說的外源性皮膚老化即指皮膚光老化。

皮膚老化是機(jī)體衰老的外在反映，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎為先天之本，人的生、長、壯、衰、老過程中，主要決定于腎氣的盛衰。腎氣盛衰，可影響其他臟腑及所有組織器官，故治衰老性疾病，必以滋腎為主。脾胃為后天之本，為氣血生化之源，以榮養(yǎng)五臟六腑、形體百骸，為滋養(yǎng)元?dú)庵竞蜕?，人之盛衰與脾胃的關(guān)系至關(guān)重要，故治療衰老性疾病，亦須滋養(yǎng)脾胃。故本實驗選用腎俞、脾俞和足三里防治大鼠皮膚光老化，旨在補(bǔ)。腎填精，健脾益胃。

機(jī)體的衰老源于細(xì)胞的衰老，自由基學(xué)說認(rèn)為：自由基攻擊細(xì)胞膜，使膜中多元不飽和脂肪酸過氧化，從而損害細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，是造成衰老的主要機(jī)理。MDA是氧自由基攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸而形成的脂質(zhì)過氧化物，它能生成聚合物并與人體內(nèi)的蛋白質(zhì)和脫氧核糖核酸發(fā)生反應(yīng)，使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變異，導(dǎo)致變異蛋白質(zhì)的細(xì)胞失去正常功能，甚至導(dǎo)致癌癥。此外，MDA聚合物還能阻礙脫氧核糖核酸的復(fù)制而使人的老化過程加快，使人壽命縮短。因此對MDA的檢測可反映出機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化和機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的損傷程度。機(jī)體具有自由基的清除系統(tǒng)，包括低分子清除劑和酶性清除劑兩種。GOD、GSH-Px是體內(nèi)自由基清除系統(tǒng)中最重要的酶類。SOD是機(jī)體唯一能淬滅自由基的酶，可以把有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為H₂O₂。盡管過氧化氫仍是對機(jī)體有害的活性氧，但體內(nèi)活性極強(qiáng)的GSH-Px則能使H₂O₂迅速清除分解為完全無害的水，兩者共同作用能有效地阻止組織細(xì)胞受過氧化的損傷。

我們在前期的研究觀察了中藥提取物(如絞股藍(lán)、黃芪)對光老化小鼠和自然衰老小鼠皮膚組織中SOD、MDA、羥自由基(OH·)、羥脯氨酸(HYP)等指標(biāo)的影響，結(jié)果均證實上述中藥具有清除自由基和提升相關(guān)酶類活性的作用。本實驗觀察結(jié)果顯示針刺組大鼠皮膚組織各種酶活性均有升高，MDA含量下降，與模型組均有明顯的差異。因而證實針刺亦可提高人鼠體內(nèi)老化相關(guān)酶的活性，增加抗自由基能力，從而對抗UV造成的皮膚光老化。