陳俊飛

摘 要 近來研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動可以誘導(dǎo)骨骼肌大量表達(dá)白細(xì)胞介素-6（IL-6），并在能量代謝過程中發(fā)揮著重要作用。IL-6基因多態(tài)性可影響其蛋白的表達(dá)和生物功能的發(fā)揮，因而IL-6基因多態(tài)性成為代謝性疾病的遺傳篩查、運(yùn)動員遺傳選材等關(guān)注的焦點(diǎn)。有研究分別分析了-572C/G、-634C/G位點(diǎn)多態(tài)性，也有研究同時分析這兩個位點(diǎn)的多態(tài)性，但其研究中顯示等位基因、基因型分布頻率極為相似，那么這兩個位點(diǎn)是否是高度連鎖的不同位點(diǎn)？還是這兩個位點(diǎn)其實(shí)就是同一位點(diǎn)？本研究運(yùn)用PCR-RFLP、基因測序及序列比對（BLAST），從不同角度對-572C/G、-634C/G位點(diǎn)是否是同一位點(diǎn)進(jìn)行分析。

關(guān)鍵詞 IL-6 基因多態(tài)性 -572C/G -634C/G 同一位點(diǎn)

中圖分類號：R392.13 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Interleukin-6 Gene Polymorphism of -572G/C and

-634G/C Point to the Same Site Analysis

CHEN Junfei

(Jiangsu Institute of Sports Science, Nanjing, Jiangsu 210033)

Abstract Recent study has found that exercise can induce large amounts of IL- -6 expression in skeletal muscle (IL-6), and played an important role in the energy metabolism processes. IL-6 gene polymorphism may affect its expression and biological function of proteins and IL-6 gene polymorphism of metabolic diseases of genetic screening, genetic selection of athletes and other focus of attention. Study analysis, respectively -572C/G, -634C/G locus polymorphism, there are research and analysis of polymorphism of both sites, but their research shows the allele, genotype frequency distribution very similar, this is a high point two chains of different sites? Are these two points is the same point? This study using PCR-RFLP, genes, sequencing and sequencealignments (BLAST), from a different perspective, and analysis on-572C/G and -634C/G point at the same point.

Key words IL-6; gene polymorphisms; -572C/G; -634C/G; at the same point

0 前言

眾所周知，體育鍛煉可以提高機(jī)體的免疫力，那么其究竟如何改善機(jī)體的免疫能力呢？研究者進(jìn)行了運(yùn)動與免疫方面的研究，結(jié)果顯示IL-6對運(yùn)動的反應(yīng)是最明顯的。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動能夠誘導(dǎo)骨骼肌表達(dá)IL-6，并參與能量代謝，IL-6不僅可以增加骨骼肌對葡萄糖攝取和利用，而且能增加脂肪酸氧化。

在醫(yī)學(xué)中，研究人員在密切關(guān)注IL-6與代謝性疾病的遺傳、發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)關(guān)系；與體育科學(xué)中，IL-6也被用于遺傳選材的研究等。隨著對IL-6越來越多的關(guān)注和研究的深入，關(guān)于IL-6基因多態(tài)性的文獻(xiàn)也越來越豐富。其中，有研究分別分析了-572C/G、-634C/G位點(diǎn)多態(tài)性，也有研究同時分析這兩個位點(diǎn)的多態(tài)性，但其研究中顯示等位基因、基因型分布頻率極為相似，那么這兩個位點(diǎn)是否是高度連鎖的不同位點(diǎn)？還是這兩個位點(diǎn)其實(shí)就是同一位點(diǎn)？本研究試圖運(yùn)用多種方法系統(tǒng)、準(zhǔn)確論證IL-6基因-572C/G、-634C/G位點(diǎn)是否是同一位點(diǎn)進(jìn)行分析。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

研究對象來自北京市城區(qū)某中學(xué)（12~15歲）142名學(xué)生，其中男生63人，女生79人，父母均為北方平原漢族。

1.2 研究方法

1.2.1 -634C/G、 -572C/G位點(diǎn)引物序列比對

分別對文獻(xiàn)中所引用的-572C/G、-634C/G位點(diǎn)引物在UCSC上的(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?org=human) 進(jìn)行BLAST，鑒別PCR產(chǎn)物是否是IL-6基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.2聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）法基因分型

所有受試者空腹抽取靜脈血，采用胍鹽酸法提取基因組DNA，PCR-RFLP法對多態(tài)位點(diǎn)等位基因進(jìn)行基因型分型。 -572C/G、-634C/G引物分別采用文獻(xiàn)中的引物，引物由北京賽百成盛有限公司合成。引物序列如下：

分別進(jìn)行基因序列擴(kuò)增，-634C/G 位點(diǎn)：PCR反應(yīng)體系20 l，包括0.4 l基因組DNA，10譖CR Buffer 2 l，TaqDNA 聚合酶1U，2.5mmol/L dNTPs 0.6 l，10 M上下游引物各1 l，ddH2O 14.5 l。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性反應(yīng)4min ；94℃變性 30s，58℃退火 30s，72 ℃延伸 30s，30 個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。-572C/G 位點(diǎn)：PCR反應(yīng)體系20 l，包括0.3 l基因組DNA，10譖CR Buffer 2 l，TaqDNA 聚合酶1U， 2.5mmol/L dNTPs 0.6 l，10 M上下游引物各1 l，ddH2O 15.5 l。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性反應(yīng)4min ；94℃變性 30s，57℃退火 30s，72 ℃延伸 30s，30 個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物均用MbiI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，反應(yīng)終產(chǎn)物進(jìn)行跑膠，在紫外燈下判斷多態(tài)位點(diǎn)基因型。IL-6 基因-634C/ G多態(tài)性，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為181 bp，根據(jù)限制性內(nèi)切酶MbiI 酶切片段的情況，基因型有3 種，CC 型(181bp 1 條帶)，CG型(181bp，121bp，60bp 3 條帶)，GG型(121bp，60bp 2 條帶)。IL-6 基因-572C/ G多態(tài)性，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為182 bp，根據(jù)限制性內(nèi)切酶MbiI 酶切片段的情況，基因型有3 種，CC 型(182bp 1 條帶)，CG型(182bp，122bp，60bp 3 條帶)，GG型(122bp，60bp 2 條帶)。

1.2.3 PCR產(chǎn)物基因測序

隨機(jī)抽取不同基因型受試者的PCR產(chǎn)物6份（每種基因型2份），對rs1800796位點(diǎn)的部分PCR產(chǎn)物用ABI PRISM 3730XL測序儀進(jìn)行序列測定，測序試劑為BigDye terminator v3.1。測序結(jié)果經(jīng)Chromas軟件對待檢位點(diǎn)分析堿基類型。基因測序工作由上海生工生物工程有限公司(sangon)完成。

1.3 統(tǒng)計分析

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 11.5（SPSS software for Windows 11.5 package）統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。多態(tài)位點(diǎn)的基因型分布情況進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗，檢驗樣本是否來自同一群體。不同組間多態(tài)位點(diǎn)的分布頻率的差異采用卡方檢驗。

2 研究結(jié)果

2.1 引物比對結(jié)果

在UCSC上 (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?org=human)分別對引物進(jìn)行BLAST，結(jié)果顯示產(chǎn)物是IL-6基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.2 聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）法基因分型結(jié)果

圖1 不同基因型PCR片段測序結(jié)果

IL-6基因-572C/G、-634C/G位點(diǎn)等位基因分布一致：C（197），G（101），且基因型分布頻率一致：CC（66人），CG（67人），GG（14人），均符合Hardy-weinberg平衡檢驗（ 2 = 0.507，P = 0.476），樣本均來源于同一群體。

2.3 PCR產(chǎn)物基因測序結(jié)果

PCR產(chǎn)物測序結(jié)果顯示：同一受試者基因型一致，且兩個產(chǎn)物序列一致?；驕y序圖如圖1所示。

3 分析與討論

3.1 引物比對結(jié)果分析

對文獻(xiàn)[5]中IL-6基因 -634C/G位點(diǎn)和-572C/G位點(diǎn)引物BLAST結(jié)果顯示產(chǎn)物是IL-6基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。這與引物引自IL-6基因多態(tài)研究文獻(xiàn)是一致的。

3.2 等位基因分布及基因型分布頻率分析

文獻(xiàn)中對于這兩個位點(diǎn)同時的分析，也是發(fā)現(xiàn)其等位基因分布、基因分布頻率相似。本研究結(jié)果顯示IL-6基因-572C/G、-634C/G位點(diǎn)等位基因分布一致：C（197），G（101），且基因型分布頻率一致：CC（66人），CG（67人），GG（14人），均符合Hardy-weinberg平衡檢驗（ 2 = 0.507，P = 0.476），樣本均來源于同一群體。因此，-572C/G與-634C/G位點(diǎn)極可能是高度連鎖的兩個多態(tài)位點(diǎn)，或者這兩個位點(diǎn)其實(shí)是同一位點(diǎn)。故有必要對PCR產(chǎn)物的序列進(jìn)行測序，研究兩個位點(diǎn)是否在同一位置。

3.3 位點(diǎn)一致性分析

所有-634C/G位點(diǎn)的研究文獻(xiàn)中所用的引物，均是引用前人，追其源頭，實(shí)際上是來源于1999年發(fā)表的文獻(xiàn)，而人類基因組草圖于2001年初在《自然》和《科學(xué)》雜志上公布，公布時草圖還有許多缺陷，一些定位并不準(zhǔn)確，隨后科學(xué)家后續(xù)的序列測定和檢驗，使基因圖精度不斷提高，達(dá)到99.9%以上。并且從最新的dpSNP數(shù)據(jù)庫中IL-6基因并沒有-634C/G SNP位點(diǎn)。

本研究對不同基因型PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因序列測定，并將產(chǎn)物序列在NCBI上(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi ?taxid=9606)進(jìn)行序列比對，結(jié)果顯示兩個產(chǎn)物序列一致，多態(tài)位點(diǎn)的位置相同，且同一受試者基因型一致，這兩個多態(tài)位點(diǎn)是同一個位點(diǎn)，即rs1800796多態(tài)位點(diǎn)。

因而，在我們今后的研究和分析中，就可以把以前關(guān)于-634C/G位點(diǎn)和-572C/G位點(diǎn)的研究成果放在一起共同討論。這將極大豐富、并綜合以往關(guān)于IL-6基因多態(tài)性研究的成果。

3.4 位點(diǎn)表述的準(zhǔn)確性分析

由于該位點(diǎn)位于IL-6基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-572位，故-634C/G的描述并不準(zhǔn)確，準(zhǔn)確的表述是-572C/G。

4 結(jié)論

（1）文獻(xiàn)中所述的IL-6基因-634C/G位點(diǎn)與大多文獻(xiàn)所述的-572C/G位點(diǎn)是同一位點(diǎn)，即rs1800796。

（2）關(guān)于IL-6基因-634C/G位點(diǎn)和-572C/G位點(diǎn)研究文獻(xiàn)中的研究結(jié)果可以放在一起共同討論。

參考文獻(xiàn)

[1] Pedersen BK, Toft AD. Effects of exercise on lymphocytes and cytokines. Br J Sports Med. 2000. 34(4): 246-51.

[2] Nielsen AR, Pedersen BK. The biological roles of exercise-induced cytokines: IL-6, IL-8, and IL-15. Appl Physiol Nutr Metab. 2007. 32(5): 833-9.

[3] 韋葉生,李壯,覃羽華.白細(xì)胞介素- 6 基因啟動子多態(tài)性與血脂及血小板計數(shù)關(guān)系的研究.中國醫(yī)師雜志,2005.7(5):583.

[4] Kim JG, Ku SY, Lim KS, et al. Cytokine production by whole blood cells: relationship to interleukin gene polymorphism and bone mass. J Korean Med Sci. 2005. 20(6): 1017-22.

[5] Jang Y, Kim OY, Hyun YJ, et al. Interleukin-6-572C>G polymorphism-association with inflammatory variables in Korean men with coronary artery disease. Transl Res. 2008. 151(3): 154-61.