鄭琴芳 汪賽嬌 周丐曉 鄭蔚虹

摘 要 本實(shí)驗(yàn)利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)研究5個(gè)中國(guó)水仙（Narcissus tazetta var. chinensis Boem&Chen）居群的遺傳多樣性。從40個(gè)隨機(jī)引物中篩選出8個(gè)有效引物，共擴(kuò)增出69個(gè)可分析位點(diǎn)，其中多態(tài)位點(diǎn)65個(gè)，多態(tài)性條帶比率（PPL）為94.20%。實(shí)驗(yàn)表明基因分化系數(shù)（Gst）平均值為0.0622，居群間的基因流（Nm）為7.5378，上述結(jié)果表明中國(guó)水仙居群的遺傳變異大部分存在于居群內(nèi)部，5個(gè)居群間的基因交流很高，種群間的分化很少。

關(guān)鍵詞 中國(guó)水仙 居群 ISSR 遺傳多樣性

中圖分類號(hào)：S688文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

ISSR Analysis on Chinese Narcissus Group Genetic Diversity

ZHENG Qinfang, WANG Saijiao, ZHOU Gaixiao, ZHENG Weihong

(College of Life and Environmental Sciences, Wenzhou University, Wenzhou, Zhejiang 325000)

Abstract In this study, study on ISSR markers of five Chinese narcissus (Narcissus that tazetta var chinensis, the Boem & Chen) population genetic diversity. The eight primers selected from 40 random primers amplified a total of 69 analyzed sites of polymorphic loci and 65, the percentage of polymorphic bands (PPL) is 94.20%. Experiments show that the average gene differentiation coefficient (Gst) was 0.0622, gene flow among populations (Nm) 7.5378, the above results show that Xianju group of Chinese water most of the genetic variation within populations, five genes among populations the exchange of high population differentiation.

Key words Chinese narcissus; droup; ISSR; genetic diversity

中國(guó)水仙（Narcissus tazetta var. chinensis Boem &Chen）為石蒜科（Amaryllidaceae）水仙屬多花水仙的一個(gè)變種，主要分布在我國(guó)的福建、浙江、江蘇和臺(tái)灣、上海等地。中國(guó)水仙栽培歷史悠久，但是由于中國(guó)水仙為三倍體，很難自然和人工雜交產(chǎn)生新品種，而且新品種培育困難，導(dǎo)致數(shù)百年來(lái)中國(guó)水仙品種稀少，少有創(chuàng)新，乃中國(guó)水仙一大遺憾。并且近年來(lái)中國(guó)水仙野生資源喪失嚴(yán)重。因此，很有必要對(duì)中國(guó)水仙的遺傳多樣性進(jìn)行深入研究。

簡(jiǎn)單序列重復(fù)間區(qū)（inter-simple sequence repeat，ISSR）是目前常用的分子標(biāo)記技術(shù)。ISSR是在SSR的3端或5端加錨1~4個(gè)嘌呤或嘧啶堿基，并以此作為引物，一般為16~18個(gè)堿基序列，對(duì)兩側(cè)具有反向排列SSR的一段DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。再根據(jù)譜帶的有無(wú)及相對(duì)位置，來(lái)分析不同樣品間的多態(tài)性。這種分子標(biāo)記方法具有簡(jiǎn)便、耗資少、模板DNA用量少、多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于生物品種和居群間的遺傳多樣性研究。

1 材料和方法

1.1 植物材料

實(shí)驗(yàn)材料中國(guó)水仙的采集均利用植物遺傳多樣性的策略進(jìn)行。每個(gè)居群采取20~30個(gè)體的葉片，分別裝袋，硅膠干燥，并置于-70℃超低溫冰箱中保存、備用。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

采用Biospin植物基因組DNA試劑盒法提取，具體操作步驟參照廠家說(shuō)明。每個(gè)居群20個(gè)樣本，共提取100個(gè)DNA基因組。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

在預(yù)備實(shí)驗(yàn)中，對(duì)40個(gè)ISSR引物進(jìn)行篩選，各選出8個(gè)能擴(kuò)增出條帶清晰且具多態(tài)性帶型的引物。根據(jù)PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取最佳組合的反應(yīng)濃度。25 L ISSR-PCR體系中，dNTP的濃度200 mol·L-1，引物濃度1.6 mol·L-1，Mg2+濃度2.0mmol·L-1，TaqDNA 聚合酶1.5U，模板DNA濃度為9 ng/ L。

ISSR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，52~60℃退火1min，72℃延伸1min30s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后72℃繼續(xù)延伸7min。

PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)含有NA-red染料（2000：1）的1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，最后用凝膠成像系統(tǒng)（UVP）記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖1 引物ISSR-824擴(kuò)增的ISSR帶型

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

將記錄的圖譜于Labworks 4.6軟件中進(jìn)行分析。同一引物在相同位點(diǎn)，根據(jù)條帶的有（1）無(wú)（0）得到二元資料，形成0，1矩陣；在POPGENE32軟件中進(jìn)行分析，計(jì)算出樣品間的Nei s相似性系數(shù)，并構(gòu)建五個(gè)種群的系統(tǒng)樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR-PCR擴(kuò)增

8個(gè)ISSR引物共擴(kuò)增得到4886條譜帶，檢測(cè)到的清晰而且可重復(fù)的有效位點(diǎn)為69個(gè)，其中多態(tài)性條帶65個(gè)，占總帶數(shù)的94.20%；如圖1所示為issr-824引物對(duì)5個(gè)居群水仙的擴(kuò)增結(jié)果。每個(gè)引物擴(kuò)增出的DNA片段為7~10個(gè)，平均8.62個(gè)；各位點(diǎn)的DNA片段長(zhǎng)度集中在200~2000 bp之間。

2. 2 5個(gè)居群水仙的聚類分析

圖2 基于中國(guó)水仙種群間Neis無(wú)偏差遺傳距離構(gòu)建的UPGMA 聚類圖

利用 POPGENE32軟件計(jì)算中國(guó)水仙種群間的Neis無(wú)偏差遺傳距離（D）和遺傳一致度（I）。ISSR標(biāo)記中，五個(gè)中國(guó)水仙種群間的Neis 無(wú)偏差遺傳距離在0.0229~0.0583之間（表1）。最后根據(jù)Neis遺傳一致度和遺傳距離，形成一個(gè)樹(shù)型的UPGMA聚類圖（圖2）。

從圖2可以看出在ISSR標(biāo)記中，南麂一區(qū)和南麂二區(qū)兩種群之間遺傳距離最小（D = 0.0229），兩者之間的遺傳相似系數(shù)最大（I = 0.9774），首先聚為一類；接著是上海崇明和舟山普陀；最后和福建平潭聚在一起。以上聚類圖進(jìn)一步揭示了水仙居群的分化趨勢(shì)和親緣關(guān)系。其中最高遺傳相似系數(shù)（I = 0.9774）與最低遺傳相似系數(shù)（I = 0.9434）相差僅0.0340，這表明5個(gè)種群之間有著較高的相似性，遺傳背景較為接近。

表1 中國(guó)水仙種群間的 Neis無(wú)偏差遺傳距離（對(duì)角線以下）及遺傳相似系數(shù)

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5個(gè)中國(guó)水仙居群，共100個(gè)樣品基因組有較豐富的多態(tài)性。本文也得出中國(guó)水仙種群間有著較高的相似性，其遺傳背景也較為接近，這與陳林姣、吳菁華等人所揭示的水仙品種親緣關(guān)系較為密切，遺傳背景基本一致的結(jié)論相同。根據(jù)各居群的Neis遺傳距離所繪制的UPGMA樹(shù)狀聚類圖可得出，各居群的地理位置對(duì)遺傳距離有一定的影響作用。南麂一區(qū)和南麂二區(qū)的距離最近，首先聚為一類；上海崇明和舟山普陀的距離次之，聚為第二類；最后和地理位置最遠(yuǎn)的福建平潭聚在一起。地理較近的居群聚在一起，表現(xiàn)出比較明顯的地域性，說(shuō)明各居群的親緣關(guān)系與地理分布有著密切的關(guān)系。