田劍敏　程美萍　張迪亞

[摘要] 目的 通過建立大鼠在限制性應(yīng)激條件下實(shí)驗(yàn)性牙周炎動(dòng)物模型，探討限制性應(yīng)激在實(shí)驗(yàn)性牙周炎發(fā)展過程中的作用。 方法 48只雄性SD大鼠用0.012 mm不銹鋼絲線結(jié)扎左上頜第一磨牙后，隨機(jī)分為兩組，一組為應(yīng)激組（給予限制性應(yīng)激），另一組為非應(yīng)激組（單純結(jié)扎）。每組大鼠分別在施加應(yīng)激后第2、3、4、5周隨機(jī)各取6只處死，檢測(cè)牙齦指數(shù)、應(yīng)激指標(biāo)促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）和皮質(zhì)酮激素（corticosterone，CORT）在血清中的含量以及牙槽骨喪失程度（attachment loss，AL）。應(yīng)用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果 大鼠結(jié)扎后的左上頜第一磨牙牙齦指數(shù)均高于未結(jié)扎的右上頜第一磨牙，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；應(yīng)激組ACTH和CORT含量均高于非應(yīng)激組（P < 0.01）；應(yīng)激組結(jié)扎區(qū)AL明顯高于非應(yīng)激組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；應(yīng)激組前4周AL與時(shí)間呈正比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 應(yīng)激可以加重牙槽骨的吸收，并且隨著應(yīng)激時(shí)間的增加，牙槽骨吸收的程度也會(huì)有所增加。

[關(guān)鍵詞] 限制性應(yīng)激；牙周炎；牙槽骨喪失；促腎上腺皮質(zhì)激素；皮質(zhì)酮激素

[中圖分類號(hào)] R781.4[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1673—9701（2012）24—0017—03

Effect of restraint stress on the progression of alveolar bone resorption in experimental periodontitis

TIAN Jianmin1 CHENG Meiping2 ZHANG Diya3

1.Department of Stomatology，Changxing County People''s Hospital in Zhejiang Province，Changxing 313100，China；2.Department of Stomatology，Dongyang City People''s Hospital in Zhejiang Province，Dongyang 322100，China；3.Department of Stomatology，the Affiliated Second Hospital of Medicine College in Zhejiang University，Hangzhou 310009，China

[Abstract] Objective To discuss the effect of restraint stress on the development and progression of experimental periodontitis，through the establishment of experimental periodontitis animal models under restraint stress condition. Methods Forty—eight male SD rats were selected with stainless steel wire （0.012 mm） ligating the left maxillary first molar and they were randomly divided into two groups：stress group （the rats were treated with restraint stress and ligation） and control group（the rats were treated with simple ligation）. Six rats were randomly selected and killed from each of group after stress was applied for 2，3，4，5 weeks. The related gingival index （GI）， the levels of adrenocorticotropic hormone （ACTH） and corticosterone （CORT） in serum， and the degree of attachment loss were tested. Statistical analysis was carried on by using the software of SPSS 10.0. Results The GI in rats left maxillary first molar ligating with the stainless steel wire were significantly higher than the right maxillary first molar without ligation （P < 0.01）； the contents of ACTH and CORT， the AL in stress group were significantly higher than the control group， there were all significant differences （P < 0.01）. The AL of the stress group in the first four weeks was proportional to the time， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Restraint stress can increase the absorption of alveolar bone，and with the stress time increases，the degree of alveolar bone loss will increase.

[Key words] Restraint stress； Periodontitis； Attachment loss； Adrenocorticotropic hormone； Corticosterone

牙周炎（periodontitis）是人類最常見的口腔感染性疾病之一，是造成牙槽骨吸收、牙松動(dòng)脫落的主要原因，對(duì)口腔組織的健康有很大的危害。大量研究發(fā)現(xiàn)，牙周微生物在牙周病的發(fā)病中是必需的始動(dòng)因素，但單純的細(xì)菌因素不足以解釋疾病的復(fù)雜性和嚴(yán)重性，易感的宿主以及某些能增加宿主易感性的因素是影響牙周病發(fā)生、發(fā)展和對(duì)治療反應(yīng)的重要因素。應(yīng)激（stress）指機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)所處的一種狀態(tài)，此狀態(tài)的基礎(chǔ)是體內(nèi)出現(xiàn)一系列神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)。許多心理免疫學(xué)和流行病學(xué)研究證實(shí)，免疫系統(tǒng)作為牙周病的調(diào)節(jié)因素， 可被心理應(yīng)激反應(yīng)通過神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)影響并調(diào)節(jié)牙周炎的發(fā)生。

本研究擬通過建立大鼠應(yīng)激牙周炎實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，探討限制性應(yīng)激在實(shí)驗(yàn)性牙周炎發(fā)生發(fā)展過程中的作用，從而為進(jìn)一步闡明應(yīng)激在牙周炎發(fā)生過程中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1建立大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎動(dòng)物模型

清潔級(jí)雄性SD大鼠48只，6周齡，體重160～180 g，購于浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。無特殊致病菌的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后實(shí)驗(yàn)。這項(xiàng)研究中所有大鼠的處理根據(jù)浙江大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)實(shí)驗(yàn)協(xié)議。

實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型的建立：參照Kimura等[7]的方法，選定大鼠左上頜第一磨牙為實(shí)驗(yàn)牙，在其頸部用浸有牙周致病菌的0.012 mm不銹鋼結(jié)扎絲進(jìn)行結(jié)扎，并使結(jié)扎絲盡量位于齦溝內(nèi)，結(jié)扎絲在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中一直保留作為口腔微生物的滯留裝置。右上頜第一磨牙不做任何處理，作為陰性對(duì)照。

1.2 牙齦指數(shù)的測(cè)量

參照文獻(xiàn)報(bào)道[8]對(duì)牙齦情況進(jìn)行分級(jí)，分為4級(jí)：0表示牙齦健康；1表示牙齦輕度炎癥：牙齦的顏色有輕度改變并輕度水腫，探診不出血；2表示牙齦中等炎癥：牙齦色紅，水腫光亮，探診出血；3表示牙齦嚴(yán)重炎癥：牙齦明顯紅腫或有潰瘍，并有自動(dòng)出血傾向。栓絲后1、2、3、4周后，使用鈍頭牙周探針檢查大鼠牙周情況，探診檢查實(shí)驗(yàn)牙牙齦的頰側(cè)中部、頰側(cè)遠(yuǎn)中和腭側(cè)中部、腭側(cè)遠(yuǎn)中，這4個(gè)點(diǎn)的均值代表該牙的分?jǐn)?shù)。

1.3 應(yīng)激刺激方案

牙周炎實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立成功后，隨機(jī)選取24只大鼠進(jìn)行限制性應(yīng)激刺激：將大鼠用自制的大鼠制動(dòng)器固定身體，動(dòng)物不能隨意移動(dòng)，不能進(jìn)食、進(jìn)水，每天制動(dòng)12 h。實(shí)驗(yàn)分組如下：空白組（G1）：包括非應(yīng)激大鼠右上頜第一磨牙；單純性牙周炎組（G2）：包括非應(yīng)激大鼠左上頜第一磨牙；限制性應(yīng)激組（G3）：包括應(yīng)激大鼠右上頜第一磨牙；限制性應(yīng)激+牙周炎組（G4）：包括應(yīng)激大鼠左上頜第一磨牙，應(yīng)激刺激方案執(zhí)行后第2、3、4、5周，在應(yīng)激大鼠和非應(yīng)激大鼠中隨機(jī)處死6只。

1.4促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）、皮質(zhì)酮 （CORT）的測(cè)定

各組大鼠處死前于非麻醉狀態(tài)下取尾部末梢血0.5 mL置于肝素抗凝管，冰凍保存待測(cè)；麻醉后心臟穿刺取血2 mL置于肝素抗凝管，37℃恒溫水浴2 h，3000 r/min離心20 min，取上清液（血漿），冰凍保存待測(cè)；將血液和血漿標(biāo)本采用放射免疫分析法分別測(cè)定腎上腺皮質(zhì)激素、皮質(zhì)酮水平。

1.5檢測(cè)牙槽骨喪失量（AL）

各組大鼠處死后取上頜骨，去凈軟組織，用1%亞甲基藍(lán)液顯示牙槽嵴頂?shù)奈恢?。測(cè)量上頜第一磨牙頰側(cè)中部、頰側(cè)遠(yuǎn)中、腭側(cè)中部、腭側(cè)遠(yuǎn)中的釉牙骨質(zhì)界至牙槽嵴頂?shù)木嚯x，這4個(gè)位點(diǎn)測(cè)量值的均值作為該牙的牙槽骨喪失值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，組內(nèi)前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，組間不同時(shí)間點(diǎn)的比較采用方差分析。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠牙周炎動(dòng)物模型牙齦指數(shù)

在各個(gè)時(shí)間段，牙周結(jié)扎側(cè)（G2、G4組）牙齦指數(shù)明顯高于未結(jié)扎側(cè)（G1、G3組）（P < 0.01），證明牙周結(jié)扎對(duì)于大鼠牙周炎的發(fā)生有效。

2.2 ACTH和CORT檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)激組大鼠（G3、G4組）體內(nèi)的ACTH和CORT水平明顯高于同時(shí)期非應(yīng)激組大鼠（G1、G2組）（P < 0.01）。在前3周，應(yīng)激組大鼠ACTH水平呈遞增趨勢(shì)，但第5周ACTH水平含量較第4周有所下降。從第2周開始，非應(yīng)激組大鼠CORT含量逐漸增高，并且第5周非應(yīng)激組大鼠CORT含量與應(yīng)激組相比差異最明顯。

2.3 牙槽骨喪失程度（AL）

通過對(duì)G1組和G2組大鼠上頜第一磨牙AL的比較可以發(fā)現(xiàn)，栓絲后的G2組大鼠的AL均高于未栓絲的G1組大鼠（兩組比較，第2、3、4、5周 t值分別為12.38、12.02、13.07、10.95，P均 < 0.01），從第2周開始，AL逐漸增高，證明牙周炎大鼠的模型建立成功。與G2組比較，在給予限制性應(yīng)激處理后的G4組大鼠的AL均明顯高于在同一時(shí)間檢查的G2組大鼠（G2和G4兩組比較，P均< 0.01），并且第5周兩組間差異最大；通過對(duì)G4組大鼠不同時(shí)間內(nèi)檢測(cè)的AL數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可以發(fā)現(xiàn)，從第2周開始，隨著應(yīng)激時(shí)間的增加，AL也會(huì)有所增加（F = 5.606，P < 0.01）。G1組和G3組之間沒有明顯差異（P均> 0.05）。

3 討論

3.1 模型建立的評(píng)價(jià)

國外有研究結(jié)果證明，大鼠是嚙齒類動(dòng)物，其牙槽骨、牙齦及牙周組織學(xué)特征與人類相似，適合作為牙周炎動(dòng)物模型。SD大鼠的生物學(xué)特性還包含：①是晝伏夜動(dòng)雜食動(dòng)物。②喜啃咬，性情較溫順，抗病力強(qiáng)。③大鼠汗腺不發(fā)達(dá)。④嗅覺靈敏。⑤對(duì)噪聲敏感。⑥垂體、腎上腺功能發(fā)達(dá)，應(yīng)激反應(yīng)敏感，行為表現(xiàn)多樣等?；谏鲜鲞@些特性，SD大鼠非常適合建立牙周炎應(yīng)激模型[9]。牙頸部結(jié)扎是誘發(fā)大鼠牙周炎的傳統(tǒng)方法，通過結(jié)扎促進(jìn)局部菌斑、牙石堆積形成，從而引發(fā)牙周組織的破壞，已是一種較成熟的方法。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)大鼠結(jié)扎側(cè)和未結(jié)扎側(cè)牙齦指數(shù)及牙槽骨喪失測(cè)量結(jié)果的對(duì)比可以證明，牙頸部結(jié)扎可以有效導(dǎo)致大鼠結(jié)扎區(qū)牙周炎的發(fā)生。

3.2 限制性應(yīng)激牙周炎的影響

任何軀體或心理的刺激，只要到達(dá)一定強(qiáng)度，除了引起與刺激因素直接相關(guān)的特異性變化外，都可以引起一組與刺激因素的非直接關(guān)系的全身非特異反應(yīng)，這種反應(yīng)就是應(yīng)激。關(guān)于應(yīng)激對(duì)牙周炎影響的臨床研究已有很多報(bào)道，但基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究不多，尤其是在國內(nèi)，很少有相關(guān)研究。

從目前的研究結(jié)果可以得知，應(yīng)激反應(yīng)通過神經(jīng)和神經(jīng)—內(nèi)分泌調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的途徑至少有3條。第1條途徑是下丘腦—下垂體—腎上腺素（HPA）軸，第2條途徑是交感神經(jīng)系統(tǒng)，第3條途徑是感覺肽能神經(jīng)途徑。因此，應(yīng)激可以通過這3條途徑對(duì)牙周病發(fā)揮各種不同的作用。在以往的國內(nèi)外研究中，嘗試構(gòu)建心理應(yīng)激的方式有很多，例如冰敷法、減尾法、高溫刺激等不同方式來嘗試使實(shí)驗(yàn)樣本產(chǎn)生并達(dá)到預(yù)期的心理應(yīng)激反應(yīng)。但是，通過制動(dòng)來引發(fā)的限制性應(yīng)激在強(qiáng)度、頻率、持續(xù)的時(shí)間等方面便于控制，所以目前被國內(nèi)外廣大學(xué)者所采納。

本實(shí)驗(yàn)所采用的制動(dòng)器是跟據(jù)限制性應(yīng)激所需要的條件自制的一個(gè)制動(dòng)器。它在不會(huì)過分加壓的情況下，可以限制大鼠的自由活動(dòng)（力量可以調(diào)節(jié)），同時(shí)不會(huì)影響到大鼠飲水和呼吸。在將大鼠從制動(dòng)器放回籠中后方便對(duì)其進(jìn)行沖洗保持里面環(huán)境的清潔。完全符合限制性應(yīng)激制動(dòng)的要求。本實(shí)驗(yàn)在對(duì)大鼠牙周炎模型加入限制性應(yīng)激后，檢測(cè)出大鼠體內(nèi)應(yīng)激指標(biāo)ACTH和CORT含量在應(yīng)激組均增高，表明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物內(nèi)分泌系統(tǒng)對(duì)應(yīng)激刺激發(fā)生了反應(yīng)，證明應(yīng)激牙周炎動(dòng)物模型建立成功。再通過對(duì)各實(shí)驗(yàn)組AL的測(cè)量和比較，可以發(fā)現(xiàn)在加入限制性應(yīng)激這一條件后，應(yīng)激組大鼠結(jié)扎側(cè)AL明顯高于非應(yīng)激組大鼠結(jié)扎側(cè)AL，而應(yīng)激組大鼠未結(jié)扎側(cè)AL與非應(yīng)激組大鼠未結(jié)扎側(cè)AL無明顯差異，說明限制性應(yīng)激會(huì)加重已發(fā)生牙周炎的大鼠牙周組織的牙槽骨吸收，但對(duì)未發(fā)生牙周炎的大鼠牙周組織沒有影響。通過對(duì)應(yīng)激組大鼠結(jié)扎側(cè)前4周的AL進(jìn)行比較可以發(fā)現(xiàn)，隨著應(yīng)激時(shí)間的增加，AL也會(huì)增加，證明應(yīng)激時(shí)間的長短與大鼠牙周組織的AL呈正相關(guān)。

綜上所述，大鼠適合用牙頸部結(jié)扎的方法建立限制性牙周炎模型來研究應(yīng)激與牙周炎的關(guān)系。應(yīng)激對(duì)沒有發(fā)生牙周炎的牙周組織無任何影響，但對(duì)已發(fā)生了牙周炎的牙槽骨吸收有促進(jìn)作用，可以加重牙周炎的發(fā)展。隨著應(yīng)激時(shí)間的增加，牙槽骨的吸收程度也會(huì)加重。

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（收稿日期：2012—04—11）