倪兵 朱順揮 史文娟 趙蕓 谷慶節(jié) 馬繼云 張明 段能

[摘要] 目的 分析云南省個(gè)舊市婦女HPV感染狀況，探討HPV感染與宮頸病變程度的關(guān)系。 方法 用導(dǎo)流雜交基因分型技術(shù)對2 058例有性生活婦女的宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行21種HPV基因分型檢測。 結(jié)果 2 058例標(biāo)本中有20種HPV亞型被檢測出，HPV總感染率為23.9%，高危型占76.0%，低危型占24.0%，檢出前五位亞型依次為HPV52、16、58、18和CP8304。宮頸病變組HPV感染率、高危型HPV及HPV16亞型感染率顯著高于病理檢查正常組，且隨宮頸病變程度的加重感染率顯著增高（P < 0.05）。 結(jié)論 個(gè)舊市婦女HPV感染率為23.9%，高危型HPV尤其是HPV16可能是導(dǎo)致宮頸病變的主要型別。

[關(guān)鍵詞] 人乳頭瘤病毒（HPV）；宮頸病變；基因分型

[中圖分類號] R730.261[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A[文章編號] 1673-9701（2012）12-0001-03

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在全球婦女腫瘤中僅次于乳腺癌，位居第2位。HPV感染與宮頸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，高危型HPV的持續(xù)性感染是導(dǎo)致宮頸癌及癌前病變的主要致病因子，約20種以上的HPV亞型與宮頸癌的形成有關(guān)，且不同的地區(qū)、不同的種族HPV的感染率和亞型分布有所不同，導(dǎo)致宮頸病變的發(fā)生及病變程度有所差異。因此明確HPV在特定地區(qū)及不同病變宮頸組織的感染率及亞型分布差異，對HPV所致疾病的防治及HPV疫苗開發(fā)應(yīng)用有著重要的指導(dǎo)意義。為了解云南省個(gè)舊市HPV感染狀況及亞型分布規(guī)律，本研究采用導(dǎo)流雜交基因芯片技術(shù)對2 058例婦科首診人群的宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行21種HPV基因分型檢測，探討HPV亞型感染與宮頸病變發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為本地區(qū)宮頸癌的預(yù)防、高危人群篩查和特異性疫苗的研制提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2 058例標(biāo)本取自2010年6月～2011年9月我院婦科首診患者，年齡19～75歲，平均（40.5±9.1）歲?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)：①未行子宮切除手術(shù)；②就診時(shí)處于非妊娠狀態(tài)；③就診前48 h內(nèi)無性生活；④就診前24 h內(nèi)無陰道處理。所有研究對象均知情同意并自愿參加。按病理確診結(jié)果分為病理檢查正常組（354例）、慢性宮頸炎組（77例），宮頸上皮內(nèi)瘤變組（包括CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ）（44例）和宮頸癌組（16例）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集及保存由醫(yī)生以窺陰器或陰道張開器暴露宮頸，用棉簽擦去宮頸分泌物，然后使用專用的HPV采樣刷置于宮頸口2~3 cm，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)3~5圈，慢慢取出宮頸刷，將其放入有專用細(xì)胞保存液的樣本管中，折斷多余的刷柄，擰緊瓶蓋，注明編號和日期。置于4℃存放，并在一周內(nèi)完成檢測。

1.2.2 HPV分型①DNA提?。喝”４嬗袑m頸細(xì)胞的細(xì)胞保存液0.5 mL，以14000 r/min離心5 min，棄上清液后，用DNA提取試劑盒提取標(biāo)本DNA。②PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系為25 μL，包含：23．25 mL PCR-Mix，0．75 μL DNATaq酶，1 μL DNA模板。凱普基因擴(kuò)增儀擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性9 min；95℃20 s→55℃30 s→72℃30 s共40個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。③雜交過程：導(dǎo)流雜交前，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物熱變性95℃ 5 min，然后冰水浴≥2 min，同時(shí)將固定有核酸探針的膜固定在雜交儀上，加入0.8 mL雜交液預(yù)雜交≥2 min后排干，加入0.5 mL雜交液，把PCR產(chǎn)物加到薄膜上與雜交液混勻，進(jìn)行導(dǎo)流雜交≥10 min，清洗除去未結(jié)合的DNA，整個(gè)雜交過程保持在45℃。預(yù)封阻后用封阻液封閉膜，孵育5 min，排出封阻液后加入酶標(biāo)液，25 ℃溫育3.5 min。④顯色過程：用A液徹底沖洗膜，除去未結(jié)合的酶標(biāo)液后，加入NBT/BCIP底物顯色3～5 min后B液洗膜3次，蒸餾水清洗后1 h內(nèi)分析結(jié)果。通過導(dǎo)流雜交技術(shù)一次檢測HPV共21個(gè)HPV亞型，包括高危組15個(gè)亞型：16、18、31、33、35、39、45、5l、52、53、56、58、59、66和68型；低危組6個(gè)亞型：CP8304、6、ll、42、43和44型。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 11．0統(tǒng)計(jì)軟件處理，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P﹤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV分型結(jié)果圖

導(dǎo)流雜交膜上內(nèi)對照點(diǎn)和Biotin對照點(diǎn)必需為陽性，陰性對照均不顯色。HPV單一感染時(shí)，在導(dǎo)流雜交膜芯片上相應(yīng)HPV亞型探針位點(diǎn)處可見一藍(lán)紫色斑點(diǎn)，雙重或多重感染時(shí)，在膜上可見2個(gè)或2個(gè)以上顯色斑點(diǎn)。見圖1、2、3。

2.2 HPV感染狀況分析

2 058例標(biāo)本經(jīng)HPV基因分型診斷篩查出491例HPV感染陽性，HPV感染率為23.9%，各組HPV感染率見表1。不同宮頸疾病HPV檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，宮頸有病變組HPV感染率顯著高于病理檢查正常組，且隨宮頸病變程度的加重，HPV感染率逐漸增高。

2.3 HPV亞型檢出頻率分析

所檢測的21種HPV亞型除43型外均有檢出，491例HPV感染陽性患者中高危型感染占76.0%（373/491），其中以HPV52亞型檢出率最高，其他主要亞型依次為HPV16、58、18型；低危型感染占24.0%（118/491），以HPVCP8304亞型檢查率最高，見圖4。

2.4 HPV亞型與宮頸病變相關(guān)性分析

高危型HPV感染率尤其是HPV16亞型在不同宮頸病變中的檢出率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，宮頸有病變組高危型HPV及HPV16亞型感染率顯著高于病理檢查正常組，且隨宮頸病變程度的加重感染率顯著增高。見表2、3。

2.5 HPV單一感染和多重感染與宮頸病變程度相關(guān)性分析

491例HPV感染陽性標(biāo)本中檢出多重感染111例，占22.6%。其中1例感染型別數(shù)高達(dá)9種。但各組間多重感染與宮頸病變差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。

3討論

宮頸癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，是全球范圍內(nèi)女性第二大常見惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于乳腺癌。近年來，中國宮頸癌的發(fā)生有明顯上升和年輕化趨勢，發(fā)病以每年2～3%的速度增長，有報(bào)道指出，99.7%的宮頸癌患者可檢測出HPV病毒[1]。HPV感染與宮頸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，高危型HPV的持續(xù)性感染是導(dǎo)致宮頸癌及癌前病變的主要致病因子，約20種以上的HPV亞型與宮頸癌的形成有關(guān)，低危亞型感染僅誘發(fā)生殖器疣樣病變。女性一生中隨著年齡的不同，生殖道HPV感染的概率及亞型不同，不同區(qū)域HPV感染亞型也不一。因此，篩查是現(xiàn)階段預(yù)防和控制子宮頸癌的主要手段，只要定期進(jìn)行高危型HPV的檢查，做到早預(yù)防、早診斷、早治療，就可以有效減少婦女死于宮頸癌的概率。中國地域遼闊，不同地區(qū)及民族宮頸癌的主要感染型別不盡相同。云南省個(gè)舊市是流動人口較多生活環(huán)境較復(fù)雜的老工業(yè)城市，因此明確一個(gè)地區(qū)HPV致癌的主要型別，可根據(jù)感染型別預(yù)測病變進(jìn)展，指導(dǎo)臨床醫(yī)生制定合理診治方案，為評估預(yù)后，避免過度診斷及治療提供依據(jù)。這種地區(qū)間的差異提示，為獲得最佳的預(yù)防效果，HPV疫苗最好能結(jié)合當(dāng)?shù)氐腍PV流行情況來設(shè)計(jì)。

HPV感染具有顯著的地域和人群差異。在我們所研究的個(gè)舊市婦女人群中HPV感染率為23.9%，與徐州地區(qū)女性HPV感染率（26.02%）[2]接近，高于金華地區(qū)[4]女性HPV感染率（13.6%），但比武漢地區(qū)（64.5%）、紹興地區(qū)（51.54%）、寧波地區(qū)（49.4%）、粵東地區(qū)（48.3%）都低[4-7]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)HPV感染率隨宮頸病變程度的加重逐漸增高，從病理檢查正常組的19.3%增至宮頸癌組的88.9%，再次證實(shí)了HPV感染與宮頸病變及其宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。亞型分析本地區(qū)HPV感染以HPV52、16、58、18、CP8304為主要感染型別，其中HPV52（23.8%）在所有受檢人群中感染的陽性率最高，與文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道一致，但與我國新疆地區(qū)[10]報(bào)道以HPV16為主不同。已發(fā)現(xiàn)的HPV亞型約100多種，其中近40種可以感染人類的生殖器官，約20種以上的HPV亞型與宮頸癌的形成有關(guān)，且不同亞型HPV對宮頸上皮的致病性不同，如低危亞型感染僅誘發(fā)生殖器疣樣病變，而高危型HPV持續(xù)感染被認(rèn)為是宮頸癌及其癌前病變發(fā)生的主要因素。我們的研究顯示，宮頸有病變組高危型HPV尤其是HPV16亞型感染率顯著高于病理檢查正常組，且隨宮頸病變程度的加重感染率有增加趨勢，說明高危型HPV尤其是HPV16亞型感染在宮頸病變發(fā)展中的重要作用。多項(xiàng)研究認(rèn)為多重HPV感染發(fā)生宮頸癌的危險(xiǎn)性比單一感染高，但本研究中各宮頸病變組的多重HPV感染并無明顯差異，可能與樣本量較少有關(guān)，也可能與人群及地域有關(guān)，我們將在今后的研究中擴(kuò)大樣本規(guī)模進(jìn)行進(jìn)一步研究。

綜上所述，個(gè)舊市婦女人群HPV感染率為23.9%，多為高危型感染，主要感染型別依次為HPV52、16、58、18、CP8304，高危型HPV尤其是HPV16可能是導(dǎo)致宮頸病變的主要致病型別，為本地區(qū)HPV所致疾病的防治及針對性HPV疫苗開發(fā)應(yīng)用提供了重要的理論依據(jù)。

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（收稿日期：2012-01-09）