紀(jì) 軍，張 利，桑麗敏，林海龍，何學(xué)志，吳園園，顏培實(shí)，孫喜琢

(大連市中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116033)

成人自體心肌干細(xì)胞體外高效擴(kuò)增及特異性鑒定

紀(jì) 軍，張 利，桑麗敏，林海龍，何學(xué)志，吳園園，顏培實(shí)，孫喜琢

(大連市中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116033)

［目的］建立一種穩(wěn)定、高效的成人自體心肌干細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增及特異性鑒定方法。［方法］手術(shù)中取下的心臟組織標(biāo)本，通過(guò)膠原酶消化的方法獲得細(xì)胞，使用自體血清進(jìn)行貼壁培養(yǎng)和傳代的方法純化細(xì)胞，細(xì)胞增殖至3代后進(jìn)行RT-PCR基因表達(dá)檢測(cè)，流式細(xì)胞表面標(biāo)記檢測(cè)及染色體核型分析的鑒定。［結(jié)果］通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的方法可以在成人心肌組織中分離和純化心肌干細(xì)胞，并在體外可大量增殖，至3代細(xì)胞可增殖至5×107。RT-PCR鑒定其具有全能干細(xì)胞因子Nanog、Oct-4、Sox-2、Rex-1的mRNA表達(dá)，及心肌轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和GATA4的mRNA和蛋白表達(dá);表達(dá)間質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記CD29、CD90、CD105;不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)記CD45和人免疫抗原HLA-DR;且培養(yǎng)后46條染色體無(wú)移位和缺失等染色體突變。［結(jié)論］通過(guò)本研究確立了一種穩(wěn)定、高效的成人自體心肌干細(xì)胞體外培養(yǎng)，擴(kuò)增和特異性鑒定的方法，為自體心肌干細(xì)胞移植技術(shù)的臨床應(yīng)用奠定重要的基礎(chǔ)。

自體組織;心肌干細(xì)胞;基因表達(dá);流式細(xì)胞術(shù);核型分析

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為心臟是高度分化器官，沒(méi)有再生能力;心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，是不可再生的細(xì)胞。胎兒出生后的心肌細(xì)胞已永久性的退出細(xì)胞周期，在心肌損傷后不能自我更新和修復(fù)壞死心肌，心臟只能通過(guò)心肌細(xì)胞肥大來(lái)適應(yīng)心臟負(fù)荷的增加，心肌受損后心肌組織被瘢痕組織取代，最終導(dǎo)致心臟收縮功能的不可逆損傷。然而近幾年來(lái)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)，無(wú)論是在生理還是病理的情況下，心肌細(xì)胞均在不斷的更新，但更新的比例極低，包括人類在內(nèi)的成體哺乳動(dòng)物心臟組織中具有特異性心肌分化潛能的原始多能干細(xì)胞，即成體心肌干細(xì)胞(cardiac stem cells，CSCs)［1-3］，這些研究為干細(xì)胞治療缺血性心臟病帶來(lái)了希望。

但是，CSCs的研究仍處于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究階段，CSCs的分離提取，培養(yǎng)擴(kuò)增，及純化等也缺乏重復(fù)性好，穩(wěn)定性高的實(shí)驗(yàn)方法;且僅靠個(gè)別單一細(xì)胞表面抗原表達(dá)鑒定，手段單一，缺乏有效性和可靠性。干細(xì)胞研究的終極目標(biāo)是臨床上的細(xì)胞移植治療，要達(dá)到這樣的高度，干細(xì)胞的培養(yǎng)必須滿足穩(wěn)定、無(wú)污染、長(zhǎng)期培養(yǎng)后維持其基因表達(dá)的特異性和染色體保持穩(wěn)定狀態(tài)這些先決條件。本研究通過(guò)成人心肌標(biāo)本的培養(yǎng)試圖建立一種穩(wěn)定、高效的方法來(lái)獲取和鑒定CSCs，為CSCs的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供有力的實(shí)驗(yàn)方法和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

D-PBS、TrypLETM、DMEM/F12均購(gòu)自GIBCO公司，collagenaseⅡ、rh-bFGF購(gòu)自Invitrogen公司，RT-PCR引物及試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司，抗人CD29、CD90、CD105、CD45、Stro-1和HLA-DR等流式抗體購(gòu)自Backman Coulter公司，Nkx2.5及GATA4 Western blot抗體購(gòu)自Abcam公司，40 μm及70 μm濾器等實(shí)驗(yàn)耗材均購(gòu)自BD公司。

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞提取分離:心臟組織標(biāo)本(心臟瓣膜移植手術(shù)中取下的瓣膜邊緣心肌組織，約20～30 mg)無(wú)菌操作下置于培養(yǎng)皿中，滴加0.4%Ⅱ型膠原酶，將組織剪碎成0.5 mm3左右的小塊。剪碎組織置于20 mL膠原酶中，37℃空氣恒溫震蕩30 min，靜置5 min。取上清，與20 mL DMEM/F12混合，經(jīng)70 μm及40 μm濾器過(guò)濾，4℃保存;沉淀置于另20 mL膠原酶中，重復(fù)上步。兩支同時(shí)4℃，1500 r/min，離心5 min。棄上清，沉淀30 mL DMEM/F12洗1次;1 mL DMEM/F12重懸，苔盼蘭染色計(jì)數(shù)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng):提取細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，使用DMEM/F12培養(yǎng)基，含10%自體血清，添加0.4 μg/ mL的rh-bFGF。視細(xì)胞生長(zhǎng)情況每3～4 d進(jìn)行換液，換液時(shí)D-PBS洗2遍，加入DMEM/F12培養(yǎng)基并補(bǔ)充適量rh-bFGF。每8～10 d細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)進(jìn)行傳代。傳代時(shí)使用TrypLETM完全消化約10 min，等量DMEM/F12終止消化，1500 r/min，離心5 min，細(xì)胞DMEM/F12重懸，計(jì)數(shù)，適量細(xì)胞數(shù)傳代。

1.2.3 細(xì)胞mRNA表達(dá)鑒定:收集第3代2×106細(xì)胞，提取總mRNA，紫外分光光度計(jì)定量。采用一步法RT-PCR進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及PCR擴(kuò)增。檢測(cè)干細(xì)胞因子Nanog、Oct-4、Sox-2、Rex-1和心肌轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5、GATA4的mRNA表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參。PCR反應(yīng)條件:94℃，2 min;94℃，30 s;58℃，30 s;72℃，1 min(35個(gè)循環(huán));72℃，5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像及分析軟件系統(tǒng)記錄和分析mRNA表達(dá)結(jié)果。

1.2.4 Nkx2.5和GATA4的蛋白表達(dá)檢測(cè):收集第3代2×106細(xì)胞，提取總蛋白，紫外分光光度計(jì)定量。待檢測(cè)蛋白變性后，經(jīng)SDS-PAGE膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜。在含5 g/L脫脂奶粉(w/v)的PBS(加tween-20)中4℃封閉過(guò)夜。分別加入1∶800稀釋的心肌轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和GATA4的多克隆一抗，室溫孵育2 h以上，加二抗及顯色劑。使用ECL-Plus Detection System檢測(cè)免疫復(fù)合物，蛋白產(chǎn)物分別為72 kDa及44 kDa，β-actin為內(nèi)參。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記:收集第3代5×106細(xì)胞，D-PBS洗2遍，取20～50 μL的抗人CD29、CD90、CD105、CD45、Stro-1和HLA-DR抗體與細(xì)胞充分混勻，4℃避光孵育20 min，用流式清洗液洗滌2次，加適量固定液固定后用于流式細(xì)胞儀表面標(biāo)記檢測(cè)。流式檢測(cè)所得數(shù)據(jù)用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.2.6 染色體核型分析:第2代CSCs傳代至培養(yǎng)瓶中，視細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)和有絲分裂情況適時(shí)加入秋水仙素(終濃度0.05 μg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，將細(xì)胞刮離瓶底，2000 r/min，離心15 min。去上清，低滲液37℃處理5 min，固定液固定2次，50℃烤片過(guò)夜。0.025%胰酶消化30 s，吉姆薩染色后閱片，每片計(jì)數(shù)50個(gè)分裂中期相，分析10個(gè)核型。采用美國(guó)Video Test-Karyo軟件進(jìn)行染色體核型分析。

2 結(jié)果

2.1 CSCs細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖情況

從成人心肌組織中消化所得的懸浮細(xì)胞，呈圓形，單核，大小較均一。接種后一般經(jīng)過(guò)24～36 h少數(shù)細(xì)胞開(kāi)始貼壁;換液后不貼壁圓形懸浮細(xì)胞基本全部清除;培養(yǎng)7 d使用相差顯微鏡觀察，貼壁細(xì)胞增殖明顯，形態(tài)各異;傳代后細(xì)胞增殖速度明顯加快;至第3代細(xì)胞成梭形，排列較規(guī)律，具有類似心肌細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞數(shù)達(dá)到5×107以上。細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)如圖1所示。

圖1 CSCs細(xì)胞培養(yǎng)和生長(zhǎng)情況Fig 1 Cell culture and cell growth state pictures of CSCs

2.2 CSCs基因表達(dá)及蛋白表達(dá)鑒定結(jié)果

培養(yǎng)至3代的細(xì)胞仍然表達(dá)4項(xiàng)多能干細(xì)胞未分化因子:Nanog、Oct-4、Sox-2和Rex-1;并且表達(dá)具有早期心肌形成轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和、GATA4的mRNA和蛋白表達(dá)(圖2、3)。證實(shí)培養(yǎng)細(xì)胞為具有多項(xiàng)分化潛能的原始心肌干細(xì)胞。

圖2 CSCs細(xì)胞RT-PCR基因表達(dá)鑒定結(jié)果Fig 2 RT-PCR gene expression identification of CSCs

圖3 CSCs細(xì)胞Nkx2.5和GATA4的蛋白表達(dá)Fig 3 Nkx2.5 and GATA4 protein expression of CSCs

2.3 CSCs表面標(biāo)記鑒定結(jié)果

培養(yǎng)至3代的細(xì)胞表達(dá)間質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記CD29(99.9%)和CD105(100%)，部分表達(dá)間質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記CD90(36.4%)和Stro-1(3.5%);造血干細(xì)胞表面標(biāo)記CD45表達(dá)僅占3.3%;且不表達(dá)人免疫抗原HLA-DR(0.0%)(圖4)。

2.4 CSCs染色體核型分析

使用Video Test-Karyo軟件進(jìn)行染色體核型分析結(jié)果顯示:經(jīng)過(guò)3代，28 d的體外培養(yǎng)后，細(xì)胞46條染色體核型全部正常，未發(fā)現(xiàn)缺失或移位等染色體突變現(xiàn)象(圖5)。

圖4 流式CSCs細(xì)胞表面標(biāo)記鑒定結(jié)果Fig 4 CSCs cell surface antigen identified of FACS

圖5 CSCs染色體核型分析結(jié)果Fig 5 Karyotype analysis of CSCs

3 討論

一般認(rèn)為，成體哺乳動(dòng)物的心肌細(xì)胞已永久地退出細(xì)胞周期，在心肌損傷后不能自我更新和修復(fù)壞死心肌。但是，最近的研究表明，成體心臟中可能保留著早期胚胎發(fā)育的多能CSCs。心臟組織損傷后，如心肌梗塞［4-5］，心肌細(xì)胞可以再生。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為CSCs是指一種細(xì)胞膜上能夠表達(dá)一種或多種干細(xì)胞相關(guān)抗原多能干細(xì)胞表面標(biāo)志的未分化細(xì)胞，如干細(xì)胞因子受體(c-kit)，P糖蛋白(MDR)和干細(xì)胞抗原(Sca-1)等多能干細(xì)胞的表面標(biāo)志。而且這些細(xì)胞在一定條件下，能夠分化為心肌組織中的各種細(xì)胞的未分化細(xì)胞［6］。

2003年Oh等［7］進(jìn)行了心肌細(xì)胞的首次分離，他們將小鼠心臟取出后以膠原酶灌注和消化，消化后的細(xì)胞采用磁珠法分離出Sca-1+的心肌干細(xì)胞。然而，對(duì)于心肌干細(xì)胞磁珠分選及鑒定的表面標(biāo)記各研究的報(bào)道并不一致。Wang等［8］證實(shí)鼠心臟分離得到的Sca-1+/CD31-細(xì)胞體外培養(yǎng)可以誘導(dǎo)表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞及心肌細(xì)胞標(biāo)志。但是，如果無(wú)誘導(dǎo)分化因子(例如DKK-1、DMSO、BMP2、FGF4、FGF8、5 -azacytidine)的存在，Sca-1+心肌干細(xì)胞定向分化成心肌細(xì)胞的陽(yáng)性率是很低的。Laugwitz等［9］證實(shí)新生小鼠心臟中存在Isl1+細(xì)胞，這些細(xì)胞不表達(dá)Sca-1、CD31及c-kit，將其與新生心肌細(xì)胞共同培養(yǎng)可分化為成熟心肌細(xì)胞。在利用譜系追蹤技術(shù)對(duì)Isl1+細(xì)胞分化研究顯示其能夠分化為血管內(nèi)皮、心內(nèi)膜、平滑肌、傳導(dǎo)系統(tǒng)、右室及左房肌細(xì)胞譜系。雖然在新生個(gè)體心肌中Isl1+細(xì)胞普遍存在，但其在成體哺乳動(dòng)物的心臟中存在較少，目前僅在右心房中發(fā)現(xiàn)，生理功能不詳。Dawn等［10］則認(rèn)為從人心肌組織中分離得到的c-kit+細(xì)胞為心肌干細(xì)胞。事實(shí)上，小鼠、大鼠、狗和人心臟的實(shí)驗(yàn)定量數(shù)據(jù)表明在30000～40000個(gè)心肌細(xì)胞中有1個(gè)CSC，大約65%的所有CSCs共同表達(dá)3種干細(xì)胞抗原(c-kit、MDR1、Sca-1)，20%的為兩種抗原，15%為一種抗原。大概5%的細(xì)胞不表達(dá)c-kit、MDR1、Sca-1。這些表面抗原標(biāo)記物的分布的不同，是否與細(xì)胞的功能不同有關(guān)也不清楚［11-12］。

心肌的修復(fù)要求心肌細(xì)胞和冠狀血管的形成，它不可能單單通過(guò)分化成心肌就完成修復(fù)。因?yàn)樾募」Ｋ腊l(fā)生后，心肌細(xì)胞的發(fā)生并不能使運(yùn)動(dòng)功能缺失的區(qū)域恢復(fù)收縮功能，心肌細(xì)胞也不能在缺血的條件下生長(zhǎng)存活。同樣，血管的單獨(dú)產(chǎn)生不能恢復(fù)和重建梗死區(qū)心肌的收縮能力，血管不能帶來(lái)心臟的動(dòng)力，心肌重生必須利用多種表型的CSCs的協(xié)同作用。因此，依靠個(gè)別單一干細(xì)胞抗原進(jìn)行磁珠分選來(lái)獲取及鑒定CSCs的方法不僅效率低下，具有多種不確定性，同時(shí)也不利于得到多種分化潛能的CSCs。

當(dāng)然，作為多能干細(xì)胞的CSCs也表達(dá)部分胚胎干細(xì)胞(ES)的標(biāo)志物Nanog、Oct-4、Sox-2和Rex-1。它們?cè)谌芘咛ジ杉?xì)胞和生殖細(xì)胞上表達(dá)，該表達(dá)對(duì)于維持干細(xì)胞的自我更新和多能性是必要的。ES的分化可導(dǎo)致這些標(biāo)志物mRNA表達(dá)的下調(diào)。它們不僅是細(xì)胞系多能分化的主要調(diào)節(jié)因子，而且也是主要的作為鑒定全能ES細(xì)胞的標(biāo)志物［13］。CSCs也表達(dá)間質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記CD29、CD105、CD90和Stro-1等，但不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)記CD45和人免疫抗原HLA-DR［14-15］。CSCs除表達(dá)多能干細(xì)胞的某些表面標(biāo)志外，同時(shí)已開(kāi)始表達(dá)早期心肌形成轉(zhuǎn)錄因子，如Nkx2.5、肌細(xì)胞促進(jìn)因子-C(MEF-C)和GATA結(jié)合蛋白4(GATA4)等［16-17］。這些心肌形成轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)是CSCs分化發(fā)育的先決條件。早期心肌形成轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)受心肌微環(huán)境內(nèi)多種誘導(dǎo)因素如生長(zhǎng)因子和激素等的調(diào)控。在CSCs定位到損傷心肌后，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β、BMP2和Cripto-1等與CSC表面受體結(jié)合，激活干細(xì)胞內(nèi)Smads、TAK1和PI3K等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)小分子，繼而誘導(dǎo)激活轉(zhuǎn)錄因子-2(ATF-2)、GATA4、Nkx2.5和MEF-C等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，啟動(dòng)CSC的終末分化。Nkx2.5是CSCs內(nèi)最早表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子之一，參與調(diào)控CSC內(nèi)MLC-v和ANP等終末心肌分化基因的表達(dá)［18］。GATA4是具有雙重鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控α-MHC、ANP和MLC等多種終末心肌分化基因的表達(dá)［19］。干細(xì)胞內(nèi)終末心肌分化基因的表達(dá)需要轉(zhuǎn)錄因子間的相互協(xié)同。總之，多種干細(xì)胞表面標(biāo)記，全能干細(xì)胞標(biāo)志物，以及早期心肌固有轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)檢測(cè)是鑒定具有多種分化潛能心肌干細(xì)胞的重要前提。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)膠原酶消化的方法從成人心肌組織中獲得單個(gè)細(xì)胞，不采用個(gè)別單一干細(xì)胞抗原磁珠分選的方法，而是通過(guò)使用自體血清貼壁培養(yǎng)和傳代對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化和擴(kuò)增，大大提高了擴(kuò)增效率，至3代細(xì)胞可增殖至5×107以上，并且在10代后仍然保持旺盛的增殖能力。培養(yǎng)3代后的細(xì)胞不僅保持全能干細(xì)胞因子Nanog、Oct-4、Sox-2、Rex-1的表達(dá)，并且具有心肌轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5、GATA4的mRNA和蛋白表達(dá);同時(shí)表達(dá)間質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記CD29、CD90、CD105(本實(shí)驗(yàn)Stro-1呈低表達(dá))，但不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)記CD45和人免疫抗原HLA-DR;且經(jīng)過(guò)28 d體外培養(yǎng)后，染色體核型未發(fā)生缺失、移位等突變。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本實(shí)驗(yàn)的方法可以穩(wěn)定、高效的獲取和全面、可靠的鑒定具有多向分化功能的CSCs，為CSCs的基礎(chǔ)研究和成人自體CSCs移植技術(shù)的臨床應(yīng)用奠定重要的基礎(chǔ)。

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Autologous adult cardiac stem cells amplification efficiency and specific identification in vitro

JI Jun，ZHANG Li，SANG Li-min，LIN Hai-long，HE Xue-zhi，WU Yuan-yuan，YAN Pei-shi，SUN Xi-zhuo
(Department of Central Laboratory，Dalian Municipal Central Hospital，Dalian 116033，China)

［Objective］To establish a stable and efficient adult cardiac stem cells in vitro amplification and identification methods.［Methods］Heart tissue removed in surgery，the cells obtained by collagenase digestion method，using the adherent culture purified cells and passage.Cell proliferation to third-generation，gene expression detected by RT-PCR;cell surface markers detected by flow cytometry;and the karyotype identification analysised by karyotyping.［Results］Through this experiment，the cardiac stem cells in adult cardiac tissue were isolated and purified in vitro.Cells after culture maintained pluripotent stem cell factor Nanog，Oct-4，Sox-2 and Rex-1 mRNA expression，and cardiac transcription factor Nkx2.5 and GATA4 mRNA and protein expression;expressed CD29，CD90，CD105 stem cell surface marker，but not expressed the hematopoietic stem cell surface markers CD45 and human antigens HLA-DR;and chromosome mutation did not occur.［Conclusion］Through this study，establish a stable，efficient autologous adult cardiac stem cells amplification and specific identification method in vitro.And establish an important foundation of autologous cardiac stem cell transplantation for clinical application.

autologous tissue;cardiac stem cell;gene expression;flow cytometry;karyotyping

R541

A

1671-7295(2012)04-0329-06

2012-04-13;

2012-07-01

紀(jì)軍(1976-)，男，遼寧大連人，主治醫(yī)師。E-mail:cancer-1976@hotmail.com

張利，主任醫(yī)師。E-mail:tyouri19652004@yahoo.com.cn