趙艷紅，丁文勇，吳軍兵，王春仁

(1.中國食品藥品檢定研究院醫(yī)療器械檢定所生物材料和組織工程室，北京100050;2.國家食品藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心，北京100044;3.大連醫(yī)科大學(xué)生化教研室，遼寧大連116044;4.中國科學(xué)院生物物理學(xué)研究所，北京100101)

煙草凝聚物對人正常支氣管上皮細(xì)胞中ΔNp63α表達(dá)的影響

趙艷紅1，2，丁文勇3，吳軍兵4，王春仁1

(1.中國食品藥品檢定研究院醫(yī)療器械檢定所生物材料和組織工程室，北京100050;2.國家食品藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心，北京100044;3.大連醫(yī)科大學(xué)生化教研室，遼寧大連116044;4.中國科學(xué)院生物物理學(xué)研究所，北京100101)

［目的］探討ΔNp63α與吸煙型肺癌發(fā)生的關(guān)系。［方法］用煙草凝聚物處理體外培養(yǎng)正常支氣管上皮細(xì)胞HBE，并分別用Realtime PCR和Western blot檢測其ΔNp63αmRNA和蛋白的表達(dá)。同時構(gòu)建ΔNp63α的基因組啟動子載體，利用熒光素酶分析煙草凝聚物對其轉(zhuǎn)錄活性的影響。［結(jié)果］煙草凝聚物處理后，HBE細(xì)胞中ΔNp63α mRNA和蛋白的表達(dá)明顯增多，且具有劑量依賴性，以50 μg/mL濃度誘導(dǎo)效應(yīng)最明顯，mRNA和蛋白表達(dá)分別升高93%和311%。煙草凝聚物能夠顯著增強ΔNp63α啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，同樣表現(xiàn)出劑量依賴性，50 μg/mL的誘導(dǎo)效應(yīng)最明顯，轉(zhuǎn)錄活性升高140%。［結(jié)論］煙草凝聚物能夠通過增強ΔNp63α啟動子的轉(zhuǎn)錄活性而誘導(dǎo)ΔNp63α的表達(dá)，說明ΔNp63α可能與吸煙導(dǎo)致的肺癌發(fā)生相關(guān)。

煙草凝聚物;肺癌;ΔNp63α

在20世紀(jì)50年代，Doll和Hill首次進行了吸煙與肺癌關(guān)系的流行病學(xué)研究。他們的回顧性研究發(fā)現(xiàn)，吸煙與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)。吸煙時間越長，初始吸煙年齡越小的人越容易發(fā)生肺癌［1-2］。之后，吸煙與肺癌的研究一直方興未艾，越來越多的研究證實了吸煙人群比非吸煙人群更容易罹患肺癌。

p63α是抑癌基因p53的同源基因，其在細(xì)胞分化、增殖、凋亡等多個細(xì)胞生命活動中發(fā)揮了重要的作用［3］。p63α包括全長型p63α(TAp63α)和截短型p63α(ΔNp63α)兩個亞型，其中ΔNp63α表達(dá)增加與多種惡性腫瘤的發(fā)生相關(guān)［4］。已有研究表明，ΔNp63α在小細(xì)胞肺癌中處于高表達(dá)水平，說明ΔNp63α可能與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)［5-6］。最新研究發(fā)現(xiàn)，煙草凝聚物處理非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞后能夠以ΔNp63α依賴方式誘導(dǎo)COX-2基因的表達(dá)［7］。為了進一步了解ΔNp63α在吸煙導(dǎo)致肺癌過程中的生物學(xué)作用，本研究利用煙草凝聚物處理正常人支氣管上皮細(xì)胞系HBE，通過檢測ΔNp63α表達(dá)來探討ΔNp63α與吸煙型肺癌發(fā)生的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

人正常支氣管上皮細(xì)胞HBE為研究室保存。RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Invitrogen公司。Western blot試劑盒購自美國Pierce公司。所有抗體購自美國Santacruze公司。Realtime PCR試劑盒購自Takara公司。雙熒光素酶報告系統(tǒng)購自美國 Promega公司。細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑 Lipofactamine 2000購自美國Invitrogen公司。其它生化試劑購自美國Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

正常支氣管上皮細(xì)胞HBE常規(guī)培養(yǎng)在加有10%FBS、谷氨酰胺和青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2的孵箱培養(yǎng)。待細(xì)胞生長到融合度為80%～90%左右后，利用0.5%胰蛋白酶進行消化，重新接種培養(yǎng)。

1.3 煙草凝聚物

本研究使用的煙草凝聚物提取于13 mg焦油含量的紅金龍牌香煙。具體制備過程如下:將15支香煙通過50 mL注射器與收集瓶相連。香煙點燃后，通過抽吸裝置，將煙霧收集到收集瓶中。待液氮冷凍凝聚后，用10 mL DMSO將煙霧凝聚物溶解，最終將濃度調(diào)整為10 mg/mL。最后經(jīng)過濾膜過濾后保存在-80℃冰箱中。采用不同濃度(0、5、10、25、50、100 μg/mL)的煙草凝聚物處理細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

1.4 Realtime PCR

利用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，具體方法參見Invitrogen公司的說明書。采用 Takara公司的SYBR?Premix Ex TaqTMII(Perfect Real Time)試劑盒進行mRNA定量分析。引物序列如下:ΔNp63α (上游引物為5＇-TGTACCTGGAAAACAATGCCC A-3＇，下游引物為5＇-GACGAGGAGCCGTTCTGAATCT -3＇);18SRNA(上游引物為5＇-ACATCCAAGGAAGGC AGCAG-3＇，下游引物為5＇-TCGTCACTACCTCCCCGG-3＇)。18SRNA作為內(nèi)參基因。PCR體系配制參照Takara公司說明書。目的基因相對表達(dá)水平采 用 2-△△CT方 法來 計 算。即 △△CT= (CT實驗組目的基因-CT實驗組內(nèi)參基因) -(CT對照組目的基因-CT對照組內(nèi)參基因)，其中CT(Threshold cycle)為閾值循環(huán)數(shù)。為了更清晰表達(dá)各組之間表達(dá)水平的差異，將對照組的表達(dá)水平人為設(shè)定為100%。

1.5 Western blot

將待測細(xì)胞用PBS洗3次后，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，冰上孵育30 min后，經(jīng)過4℃，15000 RPM離心20 min后，收集上清，即細(xì)胞總蛋白。將蛋白定量后，取5 μg蛋白進行12%濃度的SDS-聚丙烯凝膠凝膠電泳。利用半干轉(zhuǎn)印技術(shù)將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。經(jīng)過5%脫脂奶粉封閉1 h后，與抗ΔNp63α的羊源第一抗體(sc-8609，Santa Cruz Biotech)室溫孵育2 h。然后與HRP標(biāo)記的兔抗羊第二抗體孵育1 h，最后利用化學(xué)發(fā)光試劑盒(普利萊公司)檢測熒光信號。利用Odyssey近紅外雙色激光成像系統(tǒng)采集信號。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1天，接種細(xì)胞，保證轉(zhuǎn)染時細(xì)胞融合度達(dá)到90%左右。用無血清培養(yǎng)基分別稀釋轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(Invitrogen)和質(zhì)粒。然后將二者混合，加入到待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中。4 h后，將培養(yǎng)基倒掉，加入新鮮的完全培養(yǎng)基。

1.7 ΔNp63α基因啟動子構(gòu)建

根據(jù)之前的研究報道［8］，本研究從正常人角化細(xì)胞中分離了ΔNp63α基因組片段(-1584到+61)。此片段具有較強的ΔNp63α基因轉(zhuǎn)錄活性。本研究將此序列克隆到pGL3-basic載體中，此載體是Promega公司專門為檢測基因轉(zhuǎn)錄活性而設(shè)計的。

1.8 啟動子活性分析

采用Promega公司Dual-Luciferase Reporter Assay System雙熒光素酶報告系統(tǒng)進行啟動子轉(zhuǎn)錄活性分析。具體步驟如下:于 96孔板內(nèi)用 Lipofectamine 2000瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗3遍，加入PLB細(xì)胞裂解液，待細(xì)胞充分裂解后，加入LAR II檢測液，充分混合后檢測螢火蟲熒光素酶活性，然后加入Stop＆Glo檢測液檢測海腎熒光素酶活性。然后計算二者的比值，即為熒光素酶的相對活性RLA(relative luciferase activity)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。Realtime PCR和啟動子活性分析實驗均重復(fù)3次，據(jù)此計算均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，實驗組之間差異的統(tǒng)計學(xué)分析采用Student-T檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 煙草凝聚物對ΔNp63α mRNA表達(dá)的影響

Realtime PCR結(jié)果顯示，煙草凝聚物能夠誘導(dǎo)ΔNp63α mRNA的表達(dá)，并具有一定的劑量依賴性。10 μg/mL的煙草凝聚物就能夠引起ΔNp63α mRNA表達(dá)水平升高22%。隨著濃度的升高，ΔNp63α mRNA的表達(dá)水平也逐漸升高，50 μg/mL的煙草凝聚物的誘導(dǎo)效應(yīng)最明顯，表達(dá)水平升高93%。見圖1。

圖1 煙霧凝聚物對ΔNp63α mRNA表達(dá)的影響Fig 1 The impact of cigarette smoke extracts on the expression of ΔNp63α mRNA

2.2 煙草凝聚物對ΔNp63α蛋白表達(dá)的影響

煙草凝聚物能夠誘導(dǎo)ΔNp63α蛋白的表達(dá)，并且具有一定的劑量依賴性。10 μg/mL的煙草凝聚物就能夠引起ΔNp63α蛋白表達(dá)水平升高，半定量分析表明表達(dá)水平升高68%。隨著煙草凝聚物濃度的升高，ΔNp63α蛋白的表達(dá)水平也逐漸升高，50 μg/mL的煙草凝聚物的誘導(dǎo)效應(yīng)最明顯，表達(dá)水平升高311%。

圖2 煙霧凝聚物對ΔNp63α蛋白表達(dá)的影響Fig 2 The impact of cigarette smoke extracts on the expression of ΔNp63α protein

2.3 煙草凝聚物對ΔNp63α基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響

煙草凝聚物能夠增強ΔNp63α啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，具有一定的劑量依賴性。10 μg/mL的煙草凝聚物能夠誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活性增加48%。隨著煙草凝聚物濃度的增加，轉(zhuǎn)錄活性也逐漸增強，50 μg/mL的煙草凝聚物表現(xiàn)出最大的誘導(dǎo)效應(yīng)，啟動子活性增加了140%。見圖3。

圖3 煙霧凝聚物對ΔNp63α啟動子活性的影響Fig 3 The impact of cigarette smoke extracts on the transcriptional activity of ΔNp63α promoter

3 討論

目前的研究發(fā)現(xiàn)，煙草中含有超過4000種的化學(xué)成分，其中有近60種具有致癌風(fēng)險，并且這些物質(zhì)的致癌性已經(jīng)被國際癌癥研究機構(gòu)確認(rèn)［9］。這些致癌物被人體吸收后，其代謝產(chǎn)物能夠誘發(fā)癌癥的發(fā)生。煙草中的多種致癌物可以在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)形成DNA加合物，后者能夠干擾DNA的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄過程［10］。二醇環(huán)氧化物即是一種典型的DNA加合誘導(dǎo)劑，它能夠通過脫嘌呤作用誘導(dǎo)DNA加合物的形成［11］。DNA加合物形成后一般能夠被細(xì)胞自有的修復(fù)機制所修復(fù)。如果修復(fù)失敗，可能導(dǎo)致細(xì)胞生命活動的紊亂。尤其是當(dāng)受累的DNA位于重要的癌基因序列內(nèi)的時候，可能導(dǎo)致癌基因的激活，原癌基因Ras就是一個典型的例子。Ras是20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)的一個癌基因家族，其在細(xì)胞的信號傳遞和細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［12-13］。Ras表達(dá)水平升高常見于多種惡性腫瘤中。人體的許多細(xì)胞增殖性疾病(如動脈粥樣硬化等)的發(fā)病過程也與Ras表達(dá)失調(diào)相關(guān)。Ras激活主要通過突變來實現(xiàn)，幾個位點的點突變即可以導(dǎo)致Ras的激活。最常見的Ras基因突變位點是第12、13、59或61位氨基酸密碼子［14-15］。近期研究發(fā)現(xiàn)，一種煙草中的致癌物4-甲基亞硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮(NNK)能夠誘導(dǎo)Ras基因的DNA加合物形成，從而激活Ras，最終導(dǎo)致肺癌發(fā)生［16］。本研究發(fā)現(xiàn)了一個新的與吸煙相關(guān)的易感基因，即ΔNp63α。人類p63α基因作為p53家族的一員，具有p53家族成員的典型特征。p63α基因具有3個主要功能區(qū)，分別是影響反式激活的氨基末端區(qū)(TA)、與靶DNA結(jié)合的中心區(qū)(DBD)以及隨機寡聚化區(qū)(OD)［3］。此外，其氨基末端還有一個SAM結(jié)構(gòu)域(Sterile alpha motif，SAM)，發(fā)揮類似隨機寡聚區(qū)的作用［17］。p63α包括兩種亞型，即全長型的TAp63α以及截短型的ΔNp63α。ΔNp63α缺乏反式激活區(qū)，能夠以dominant negative的方式調(diào)節(jié)抑制 TAp63α和 p53功能［3］。目前的研究報道，ΔNp63α多被認(rèn)為發(fā)揮原癌基因的功能。本研究的結(jié)果也證實了這一觀點。同時，本研究的發(fā)現(xiàn)也提示了ΔNp63α可能是吸煙導(dǎo)致肺癌發(fā)生過程中的一個重要基因。鑒于本研究的體外研究特性，進一步的臨床流行病學(xué)與病理學(xué)研究將有助于深入認(rèn)識ΔNp63α與吸煙導(dǎo)致肺癌發(fā)生的相關(guān)性。

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Promotion effect of cigarette smoke extracts on human normal bronchial epithelial cells to express ΔNp63α in vitro

ZHAO Yan-hong1，2，DING Wen-yong3，WU Jun-bing4，WANG Chun-ren1
(1.Institute for Medical Devices Control，National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China;2.Center for Medical Device Evaluation/SFDA，Beijing 100044，China;3.Biochemistry Teaching and Research Division，Dalian Medical University，Dalian 116044，China;4.Institute of Biophysics，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101，China)

［Objective］To study the correlation of ΔNp63α expression with cigarette smoking-induced lung cancer.［Methods］We cultured exposed human normal bronchial epithelial cells(HBE cells)to cigarette smoke extracts and detected the protein and mRNA levels of ΔNp63α with Western blot and realtime PCR respectively.We also cloned the genomic promoter of ΔNp63α and determined its transcriptional activity after exposure to cigarette smoke extracts.［Results］The cigarette smoke extracts induced the expression of ΔNp63α both at protein and mRNA levels significantly in a dose dependent manner.The cigarette smoke extracts at 50 μg/mL induced 93%and 311%increasing of mRNA and protein levels respectively.The transcriptional activity of the ΔNp63α promoter was also enhanced by cigarette smoke extracts in a dose dependent manner.The extracts at 50 μg/mL induced 140%increasing of transcriptional activity.［Conclusion］Cigarette smoke extracts could induce the expression of ΔNp63α by enhancing its transcriptional activity and this finding indicated that ΔNp63α might be involved in cigarette smoking-induced lung cancer.

cigarette smoke extracts;non-small cell lung cancer;ΔNp63α

Q291

A

1671-7295(2012)04-0335-04

2012-05-11;

2012-06-29

趙艷紅(1976-)，女，遼寧阜新人，博士，助研。E-mail:zhaoyanhongbj@yahoo.com.cn

王春仁，正研究員。E-mail:chunrenwang@263.net