呂 濤，李延倉(cāng)，李樹(shù)仁，牛希華，婁季鶴

(鄭州市第一人民醫(yī)院燒傷科，河南鄭州450004)

依達(dá)拉奉對(duì)脂多糖引起的小鼠急性肺損傷的保護(hù)效應(yīng)研究

呂 濤，李延倉(cāng)，李樹(shù)仁，牛希華，婁季鶴

(鄭州市第一人民醫(yī)院燒傷科，河南鄭州450004)

［目的］探討依達(dá)拉奉在急性肺損傷當(dāng)中的保護(hù)效應(yīng)及其可能的機(jī)制。［方法］成年C57小鼠54只被隨機(jī)等分為3組:正常組(假手術(shù)組)，對(duì)照組(LPS+生理鹽水)和實(shí)驗(yàn)組(LPS+依達(dá)拉奉)。將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠，采用氣道內(nèi)注入LPS溶液(2 mg/mL)1 mL/kg造急性肺損傷模型，正常組小鼠不注。實(shí)驗(yàn)組小鼠尾靜脈注射依達(dá)拉奉溶液(2 mg/mL)2.5 mL/kg，對(duì)照組小鼠注射等體積生理鹽水。24 h后，每組取6只小鼠腹腔注射過(guò)量麻醉戊巴比妥(100 mg/kg)，后斷頭處死，取肺組織用于組織學(xué)及丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、TNF-α，IL-1β和IL-6的檢測(cè)。每組余下的12只小鼠用做生存率實(shí)驗(yàn)，每12 h觀測(cè)1次并記錄小鼠存活的情況，觀察周期為4 d。［結(jié)果］實(shí)驗(yàn)組小鼠生存率明顯高于對(duì)照組(P＜0.05);LPS刺激后，小鼠肺組織內(nèi)的MDA含量由(1.41±0.119) nmol/mg上升到(4.48±0.159)nmol/mg，而依達(dá)拉奉治療后則降到(2.56±0.157)nmol/mg(P＜0.01);LPS刺激后，小鼠肺組織內(nèi)的SOD活力由(12.86±1.49)U/mg下降到(8.95±1.02)U/mg，而依達(dá)拉奉治療后則上升至(10.69± 1.77)U/mg(P＜0.01);同時(shí)，LPS刺激后，小鼠肺組織內(nèi)的TNF-α，IL-1β和IL-6含量分別由(47.89±4.71)pg/ mg、(79.39±3.45)pg/mg和(81.9±6.39)pg/mg上升到(300.48±12.18)pg/mg、(717.99±35.01)pg/mg和(428.99± 21.89)pg/mg，而依達(dá)拉奉治療后小鼠肺組織的含量則降到(191.84±6.43)pg/mg、(236.87±13.46)pg/mg和(136.92±12.47)pg/mg。病理結(jié)果顯示:依達(dá)拉奉減輕了LPS引起的肺水腫，彌漫性出血和炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)等癥狀。［結(jié)論］依達(dá)拉奉可以減輕LPS引起的急性肺損傷。

依達(dá)拉奉;脂多糖;急性肺損傷

急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(ALI/ ARDS)是指由心源性以外的各種肺內(nèi)、外致病因素導(dǎo)致的急性進(jìn)行性呼吸衰竭。ALI和ARDS具有性質(zhì)相同的病理生理改變，ARDS是嚴(yán)重的ALI，也是目前病人死亡的主要因素之一［1］。ALI的病因各不相同，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，但被激活的各種細(xì)胞經(jīng)呼吸爆發(fā)產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygens pecies，ROS)引起機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)的失衡，在ALI的病理生理過(guò)程中起到了重要作用，國(guó)內(nèi)外很多研究已經(jīng)證實(shí)通過(guò)外源性的抗氧化劑補(bǔ)給可以減輕LPS導(dǎo)致的ALI［1-3］。依達(dá)拉奉是目前臨床上廣泛應(yīng)用的一種抗氧化劑。本研究利用氣道注射脂多糖(LPS)的方法建立小鼠的急性肺損傷模型，來(lái)探討依達(dá)拉奉對(duì)小鼠急性肺損傷的保護(hù)效應(yīng)以及可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

成年的健康雄性C57小鼠54只，體重20～22 g，購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)前將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，光照條件為白天/黑夜(12 h∶12 h)循環(huán)，任其自由進(jìn)食。本實(shí)驗(yàn)的所有涉及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的操作步驟均得到河南省鄭州大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)同意。LPS和戊巴比妥購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。使用前，LPS用醫(yī)用生理鹽水配制成2 mg/mL母液。丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。TNF-α、IL-1β和IL-6檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及方法

將54只小鼠隨機(jī)分為3組，每組18只。分為正常組(假手術(shù)組)，對(duì)照組(LPS+生理鹽水)及實(shí)驗(yàn)組(LPS+依達(dá)拉奉)。將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的小鼠用氣道注射LPS的方法造急性肺損傷模型。具體過(guò)程如下:將小鼠麻醉(腹腔注射40 mg/kg的戊巴比妥)后，使其平躺于恒溫動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，鈍性分離暴露氣管，用微量注射器通過(guò)氣管穿刺的方法給小鼠氣管內(nèi)注射1 mL/kg的LPS鹽溶液，后將傷口縫合，并用碘伏對(duì)縫合區(qū)域進(jìn)行消毒。實(shí)驗(yàn)組傷后2 h尾靜脈注射2.5 mL/kg的依達(dá)拉奉注射(2 mg/mL)溶液，而對(duì)照組注射等體積的生理鹽水。在傷后24 h，3組各取6只小鼠，均過(guò)量麻醉(腹腔注射100 mg/kg體重的戊巴比妥)后斷頭處死，打開(kāi)胸腔，分離肺臟，取左肺，用4℃預(yù)冷的生理鹽水清洗并用濾紙吸干表面液體后立即置液氮內(nèi)，并在液氮冷凍狀態(tài)下研磨成粉，儲(chǔ)存于-80℃冰箱中用于氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)因子的測(cè)定;右肺固定于4%的多聚甲醛溶液中用于組織學(xué)染色。每組剩余的12只老鼠用做生存率實(shí)驗(yàn)，觀察周期為傷后4 d，每12 h觀測(cè)1次，并詳細(xì)的記錄小鼠的死亡時(shí)間。

1.3 肺組織中MDA和SOD的檢測(cè)

肺組織中MDA含量和SOD活性的測(cè)定根據(jù)商業(yè)化的試劑盒說(shuō)明書(shū)所述化學(xué)方法進(jìn)行。具體操作如下:取凍存于-80℃中約100 mg肺組織粉末加入2 mL磷酸緩沖液(pH=7.4)勻漿，12000 g，4℃離心20 min，取上清作MDA和SOD的檢測(cè)。MDA水平通過(guò)與硫代巴比妥酸反應(yīng)顯色的方法在酶標(biāo)儀中讀取535 nm波長(zhǎng)處的吸光度(absorbance，A)，MDA含量用nmol/mg蛋白表示。SOD活性通過(guò)氮藍(lán)四唑還原法即通過(guò)黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)還原亞硝酸鹽，SOD活性用U/mg來(lái)表示。

1.4 肺組織中炎癥因子的測(cè)定

取凍存于-80℃中的約10 mg肺組織粉末加入0.5 mL磷酸緩沖液(pH=7.4)勻漿，12000 g，4℃離心20 min，取上清用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)TNF-α、IL -1β和IL-6含量，在450 nm波長(zhǎng)處讀取A值，根據(jù)樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算TNF-α、IL-1β和IL-6含量。

1.5 肺組織病理學(xué)觀察

取出固定于4%多聚甲醛液中肺組織，脫水，石蠟包埋，6 μm連續(xù)切片，行常規(guī)做HE染色，用普通光鏡觀察并拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，文中數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組間參數(shù)比較采用單因素的方差分析，用Kaplan-Meier的統(tǒng)計(jì)方法來(lái)繪制統(tǒng)計(jì)圖表，同時(shí)用Log-Rank來(lái)做生存率檢驗(yàn)，將P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 依達(dá)拉奉對(duì)LPS引起的小鼠生存率的影響

本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的小鼠生存率明顯高于對(duì)照組，見(jiàn)圖1。

圖1 依達(dá)拉奉對(duì)小鼠生存率的影響Fig 1 Effect of edaravone on LPS-induced mice survival rate

2.2 依達(dá)拉奉對(duì)LPS引起的肺組織炎癥反應(yīng)的影響

傷后24 h的結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組IL-1β、TNF-α和IL-6的含量明顯低于對(duì)照組。見(jiàn)表1。

表1 依達(dá)拉奉對(duì)傷后24 h小鼠肺組織炎癥反應(yīng)的影響Tab 1 The effects of edaravone treatment on the LPS-induced inflammatory response in lung tissues at 24 h post-injury

2.3 依達(dá)拉奉對(duì)LPS刺激后肺組織SOD活力和MDA含量的影響

傷后24 h，實(shí)驗(yàn)組肺組織中的MDA含量明顯低于對(duì)照組，SOD含量明顯高于對(duì)照組。見(jiàn)表2。

表2 依達(dá)拉奉對(duì)傷后24 h肺組織中SOD活力和MDA含量的影響Tab 2 Effects of edaravone treatment on MDA content and SOD activity in lung tissues at 24 h post-injury

2.4 依達(dá)拉奉對(duì)肺組織病理形態(tài)的影響

傷后24 h肺組織HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組出現(xiàn)明顯肺水腫，彌漫性出血，肺泡間隔增寬和大量炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。而實(shí)驗(yàn)組，肺損傷的情況得到明顯減輕，見(jiàn)圖2。

3 討 論

急性肺損傷是臨床上常見(jiàn)的一種疾病，可以由嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷和休克等因素誘發(fā)，且疾病的進(jìn)程較快，常發(fā)展為ARDS，進(jìn)而危及患者生命［4-6］。表現(xiàn)為單核巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)和多種細(xì)胞因子及黏附分子的過(guò)度表達(dá)，即出現(xiàn)“細(xì)胞因子瀑布”，而肺實(shí)質(zhì)的病變表現(xiàn)為肺水腫、中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)、肺泡間隔的增寬同時(shí)也伴隨著肺細(xì)胞的凋亡［2］。氧化應(yīng)激損傷在急性肺損傷當(dāng)中發(fā)揮著重要的作用，在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷當(dāng)中，由于大量炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，導(dǎo)致呼吸鏈的爆發(fā)，從而導(dǎo)致大量的活性氧(O2-和·OH)產(chǎn)生，而大量的活性氧產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)的過(guò)氧化、DNA的損傷和蛋白酶的失活進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡［7-8］。所以抗氧化對(duì)于控制急性肺損傷的病程十分關(guān)鍵，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有用各種抗氧化劑，例如:維生素類(lèi)、N-乙酰半胱氨酸和氫氣等來(lái)治療LPS引起的急性肺損傷的相關(guān)研究出現(xiàn)［9-10］。

圖2 依達(dá)拉奉對(duì)傷后24 h小鼠肺結(jié)構(gòu)的影響(×200)Fig 2 The effects of edaravone treatment on LPS-induced lung histology changes(×200)

依達(dá)拉奉是一種新型的抗氧化劑，目前臨床上主要應(yīng)用于腦中風(fēng)后的患者。它的主要藥理機(jī)制是可以中和·OH和ONOO-等［11］。目前研究發(fā)現(xiàn)，依達(dá)拉奉對(duì)于燒傷、博來(lái)霉素、急性胰腺炎等引起的肺損傷都有一定的治療效果，但是對(duì)于LPS引起急性肺損傷的研究尚未見(jiàn)報(bào)道［12-14］。本研究建立了一個(gè)小鼠的急性肺損傷模型，來(lái)探討依達(dá)拉奉對(duì)于其治療效果的影響。

組織氧化應(yīng)激的嚴(yán)重程度取決于體內(nèi)氧自由基產(chǎn)生的速率與組織和細(xì)胞抗氧化能力之間的平衡，組織抗氧化能力則是由各種抗氧化物和酶類(lèi)自由基清除劑組成。在正常生理情況下，機(jī)體的組織和細(xì)胞內(nèi)也存在氧自由基，但它們保持在一個(gè)很低水平上發(fā)揮其生理功能。機(jī)體在組織損傷和應(yīng)激過(guò)程中產(chǎn)生大量自由基，造成自身細(xì)胞和組織器官的過(guò)氧化損傷。MDA是檢測(cè)氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)程度的常用指標(biāo)，本研究發(fā)現(xiàn):依達(dá)拉奉可以顯著的降低小鼠肺組織的MDA的水平，說(shuō)明依達(dá)拉奉可以減輕LPS引起的細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷。細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)升高和氧化應(yīng)激損傷不但與氧自由基的過(guò)量產(chǎn)生有關(guān)，也與機(jī)體對(duì)氧自由基清除能力降低有關(guān)。SOD是體內(nèi)重要的酶類(lèi)自由基清除劑之一，LPS刺激同時(shí)使肺組織的抗氧化能力降低，肺組織內(nèi)的SOD活性下降，本研究發(fā)現(xiàn)外源性的依達(dá)拉奉補(bǔ)給有助于恢復(fù)肺組織的抗氧化能力，減輕氧自由基對(duì)肺的損傷，這可能是依達(dá)拉奉減輕肺損傷的主要機(jī)理。

LPS引起的急性肺損傷的病理生理過(guò)程中，伴隨著大量炎癥因子的釋放，從而加重肺損傷。TNF-α，IL-1β和IL-6均是與急性肺損傷明顯相關(guān)的因子，研究證實(shí)，在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷中，它們的表達(dá)量均顯著的上調(diào)，本研究發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉可以減少LPS刺激后TNF-α，IL-1β和IL-6的產(chǎn)生，從而阻止了炎癥反應(yīng)的放大效應(yīng)。

LPS引起的肺損傷表現(xiàn)為肺泡間隔的增寬，肺水腫的發(fā)生，大量中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，本研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)尾靜脈注射依達(dá)拉奉可以減輕LPS引起的肺組織的水腫及中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)但是依達(dá)拉奉抑制肺損傷的機(jī)制有待于進(jìn)一步明確。

依達(dá)拉奉對(duì)LPS引起的急性肺損傷的保護(hù)效應(yīng)主要是通過(guò)減輕肺組織的氧化應(yīng)激損傷，同時(shí)保護(hù)了體內(nèi)自身的抗氧化能力，繼而阻止了肺組織促炎性細(xì)胞因子IL-1β，TNF-α和IL-6的產(chǎn)生和釋放，最終減輕了肺的病理學(xué)改變并降低了小鼠的死亡率。

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Therapeutic efficacy of Edaravone for LPS-induced acute lung injury in mice

Lü Tao，LI Yan-cang，LI Shu-ren，NIU Xi-hua，LOU Ji-he
(Department of Burn and Plastic Surgery，F(xiàn)irst People＇s Hospital of Zhengzhou，Zhengzhou 450004，China)

［Objective］To investigate the protective effects of edaravone treatment on lipopolysaccharide(LPS)-induced acute lung injury(ALI).［Methods］Fifty-four mice were randomized into 3 groups:normal group(Sham operation)，control group(LPS+physiological saline)and experiment group(LPS+Edaravone).The mice in control and experiment group were induced ALI by intra-tracheal LPS solution(2 mg/kg body weight).The mice in experiment group were given Edaravone solution(2 mg/mL)2.5 mL/kg body weight and the mice in control group were given saline at the same volume.At 24 h post-injury，6 mice in each group were killed and their lung tissues were isolated and assayed for malonaldehyde (MDA)，superoxide dismutase activity(SOD)，TNF-α，IL-1β，IL-6 and histological examination.The remained 12 mice in each group were used for monitoring the survival rate of mice every 12 h for 4 days.［Results］Our experiments exhibited that the survival rate of experiment group was higher than control group(P＜0.05).After LPS stimula-tion，MDA content in the lung tissues was increased from(1.41±0.119)nmol/mg to(4.48±0.159)nmol/mg，whereas it was decreased to(2.56±0.157)nmol/mg in the Edaravone treatment group(P＜0.01).After LPS stimulation，SOD activity in the lung tissues was decreased from(12.86±1.49)U/mg to(8.95±1.02)U/mg，whereas it was increased to(8.95 ±1.02)nmol/mg in the Edaravone treatment group(P＜0.01).After LPS stimulation，TNF-α，IL-1β and IL-6 content in the lung tissues was increased from(47.89±4.71)pg/mg，(79.39±3.45)pg/mg and(81.9±6.39)pg/mg to(300.48±12.18)pg/mg，(717.99±35.01)pg/mg and(428.99±21.89)pg/mg，whereas they were decreased to(191.84±6.43)pg/ mg，(236.87±13.46)pg/mg and(136.92±12.47)pg/mg in the Edaravone treatment group.Edaravone treatment further attenuated lung edema，inflammatory cell infiltrations，widened alveolar septum，and diffuse hemorrhage.［Conclusions］In conclusion，our data demonstrated that ameliorated LPS-induced ALI.

Edaravone;lipopolysaccharide;acute lung injury

R641

A

1671-7295(2012)04-0343-05

2011-12-07;

2012-06-29

呂濤(1970-)，男，河南鄭州人，副主任醫(yī)師。E-mail:lvtao8977@163.com