高 政，姜麗杰，邢蕓蕓，王旭剛

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院北院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧大連116031;2.大連市第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 大連116031;3.沈陽市第四人民醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧沈陽110031)

預(yù)防性應(yīng)用鹽酸氟桂利嗪對高血糖SD大鼠局部腦缺血再灌注模型ICAM-1表達(dá)的影響

高 政1，姜麗杰2，邢蕓蕓3，王旭剛1

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院北院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧大連116031;2.大連市第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 大連116031;3.沈陽市第四人民醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧沈陽110031)

［目的］探討預(yù)防性應(yīng)用鹽酸氟桂利嗪對高血糖條件下SD大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷是否有保護(hù)作用及其可能機(jī)制。［方法］雄性健康SD大鼠36只，建立高血糖模型后隨機(jī)分為兩組:高血糖組(n=18)與鹽酸氟桂利嗪+高血糖組(簡稱氟桂利嗪組，n=18)，各組按腦缺血90 min再灌注3 h(n=6)、6 h(n=6)、24 h(n=6)分為3個亞組。比較氟桂利嗪組與高血糖組各再灌注時間點(diǎn)腦組織病理形態(tài)改變及ICAM-1表達(dá)的動態(tài)變化。［結(jié)果］腦組織病理形態(tài)觀察:氟桂利嗪組隨著再灌注時間的延長，腦組織受損程度逐漸加重，但與高血糖組各時間點(diǎn)比較，變性、壞死的神經(jīng)元較少，組織間水腫較輕。ICAM-1表達(dá):氟桂利嗪組于再灌注3 h可見ICAM-1陽性表達(dá)，24 h內(nèi)逐漸增高(P＜0.05)。氟桂利嗪組與高血糖組比較各時間點(diǎn)缺血區(qū)ICAM-1表達(dá)均減少(P＜0.01)。［結(jié)論］預(yù)防性應(yīng)用鹽酸氟桂利嗪能減輕高血糖條件下的局灶性腦缺血再灌注損傷。

鹽酸氟桂利嗪;高血糖;腦缺血再灌注;細(xì)胞間粘附分子-1

急性腦梗死是臨床上常見的急危癥之一，具有很高的致死致殘率，嚴(yán)重危害人類健康，而急性腦梗死患者在發(fā)病前常合并糖尿病或在發(fā)病急性期?？梢娧巧?，許多臨床及動物實驗亦表明高血糖可加重腦缺血再灌注損傷［1-4］。細(xì)胞間粘附分子-1 (intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中細(xì)胞表達(dá)最廣泛的粘附分子，它的含量變化被認(rèn)為能反映顱腦損傷程度。本研究采用SD大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，通過觀察腦組織病理形態(tài)改變和ICAM-1表達(dá)情況，探討預(yù)防性應(yīng)用鹽酸氟桂利嗪(flunarizine hydrochlorid)對高血糖條件下的腦缺血再灌注損傷是否有保護(hù)作用，為預(yù)防性用藥提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康雄性SD大鼠36只，體重180～220 g，血糖正常(＜6 mmol/L)，由大連醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，分籠溫室飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，自然晝夜，術(shù)前禁食12 h。

1.2 主要藥品、試劑和儀器

兔抗大鼠ICAM-1抗體(福建邁新公司);SP試劑盒、DAB顯色劑(美國SANTAZ公司);氯化三苯四唑啉(TTC)(中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司);鹽酸氟桂利嗪(西安楊森公司5 mg/片);DS-88型電子稱(武漢自動化儀表廠);電熱恒溫水溫箱HW1型(北京市醫(yī)療設(shè)備廠);LEICA-RM-2145石蠟切片機(jī)(德國);NIKON數(shù)碼相機(jī)(日本);OLYMPUS光學(xué)顯微鏡(日本);微血糖儀(美國強(qiáng)生公司); HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)(同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)千屏影像工程公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組:36只健康雄性SD大鼠，按隨機(jī)化原理分為兩組:高血糖組(n=18)、鹽酸氟桂利嗪+高血糖組(簡稱氟桂利嗪組，n=18)。各組按腦缺血90 min再灌注3 h(n=6)、6 h(n=6)、24 h(n= 6)分為3個亞組。

1.3.2 給藥方法:鹽酸氟桂利嗪研磨成粉末狀，生理鹽水稀釋溶解成混懸液。給藥組大鼠在手術(shù)前3 d灌胃，1次/d，按分組情況分別給鹽酸氟桂利嗪(10 mg/kg)。

1.3.3 大鼠高血糖模型制備:大鼠術(shù)前禁食12 h，自由進(jìn)水。各組在阻斷大腦中動脈(middle cerebral artery，MCA)前30 min腹腔注射50%葡萄糖溶液(3 g/kg)。于注射葡萄糖前及栓線前各取鼠尾血1滴，用血糖儀測定血糖濃度，栓線前血糖值＞11.1 mmol/ L表示建模成功。

1.3.4 大鼠大腦中動脈閉塞的缺血再灌注模型制備:參照改良的Longa-Zea氏線栓法［5］制作大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型。模型成功的標(biāo)志是動物蘇醒后出現(xiàn)同側(cè)的Horner征(眼裂變小，眼球內(nèi)陷)和對側(cè)以前肢為重的偏癱。

1.3.5 觀察指標(biāo):免疫組織化學(xué)法測定ICAM-1的表達(dá)。判斷標(biāo)準(zhǔn):每張切片在40×10倍光鏡下隨機(jī)選取缺血區(qū)內(nèi)5個不重疊的視野，顯微鏡下觀察并計數(shù)陽性細(xì)胞，應(yīng)用HPIAS-1000圖像分析處理系統(tǒng)計數(shù)ICAM-1免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)量，取均值作為各時間點(diǎn)陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均以x ±s表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。血糖值采用配對t檢驗;兩組間的比較采用成組t檢驗;ICAM-1在氟桂利嗪組的動態(tài)變化采用單因素方差分析。以P＜0.05表示差異具有顯著性意義，P＜0.01表示差異具有非常顯著性意義。

2 結(jié) 果

2.1 腦組織病理形態(tài)檢查結(jié)果

高血糖組:腦缺血區(qū)神經(jīng)元數(shù)目減少，神經(jīng)細(xì)胞皺縮、變性，可見空泡化改變，與周圍分界清楚，胞核固縮，組織間水腫明顯，隨著再灌注時間延長，缺血神經(jīng)元損害加重，呈不可逆性神經(jīng)細(xì)胞損傷性改變，絕大多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞壞死。見圖1。

圖1 高血糖組(40×10)Fig 1 Hyperglycemia group(40×10)

氟桂利嗪組:隨著再灌注時間的延長，腦組織受損程度也逐漸加重，但與高血糖組相同再灌注時間點(diǎn)比較，變性、壞死的神經(jīng)元減少，空泡化改變減輕，組織間水腫減輕。見圖2。

圖2 氟桂利嗪組(40×10)Fig 2 Flunarizine group(40×10)

2.2 ICAM-1表達(dá)結(jié)果

氟桂利嗪組于再灌注3 h可見ICAM-1陽性表達(dá)，24 h內(nèi)逐漸增高，組內(nèi)6 h與3 h比較P＜0.01，24 h與6 h比較P＜0.05;相同再灌注時間點(diǎn)氟桂利嗪組與高血糖組比較缺血區(qū)ICAM-1表達(dá)減少，且差異有非常顯著性意義，P＜0.01。見表1。

表1 各組不同再灌注時間點(diǎn)ICAM-1的表達(dá)Tab 1 Different reperfusion time points ICAM-1 expression in each group (x ±s)

3 討論

腦血管病是嚴(yán)重危害人類生命安全的三大疾病之一，其中缺血性腦血管病占大多數(shù)，嚴(yán)重危害人類健康。而長時間的腦缺血后再灌注期間組織發(fā)生復(fù)雜的繼發(fā)性改變，加重組織損傷。目前認(rèn)為腦缺血再灌注損傷的機(jī)制包括興奮性氨基酸的釋放、炎癥反應(yīng)、基因表達(dá)的改變及細(xì)胞內(nèi)鈣超載等。而細(xì)胞內(nèi)鈣超載被認(rèn)為是引起缺血再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)。臨床發(fā)現(xiàn)腦缺血患者發(fā)病前常合并糖尿病或者在發(fā)病急性期?？梢娧巧?，許多臨床及動物實驗也已證明高血糖可以加重腦缺血再灌注損傷。鹽酸氟桂利嗪作為第四代Ca2+拮抗劑，具有抑制病理性過量Ca2+內(nèi)流而不影響正常Ca2+向細(xì)胞內(nèi)流入的作用，是目前鈣通道阻滯劑中能透過血腦屏障的藥物之一，作用于神經(jīng)元及血管的電壓依賴性鈣通道，從而阻滯腦缺血再灌注條件下的Ca2+內(nèi)流，目前臨床已普遍應(yīng)用于治療早期缺血性腦梗死。張秋鈴等［5］進(jìn)行動物實驗研究發(fā)現(xiàn)預(yù)防性應(yīng)用鹽酸氟桂利嗪能明顯減輕缺血再灌注對神經(jīng)細(xì)胞的損傷，但至今為止，關(guān)于預(yù)防性應(yīng)用鹽酸氟桂利嗪對高血糖條件下的腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用的研究國內(nèi)外尚未見報道。本實驗對腦缺血區(qū)的形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，高血糖組缺血區(qū)神經(jīng)元數(shù)目減少，神經(jīng)細(xì)胞皺縮，變性，可見空泡化改變，與周圍分界清楚，胞核固縮，組織間水腫明顯，隨著再灌注時間延長，缺血神經(jīng)元損害加重，呈不可逆性神經(jīng)細(xì)胞損傷性改變，絕大多數(shù)神經(jīng)元壞死。氟桂利嗪組隨著再灌注時間延長，組織受損程度也逐漸加重，但與高血糖組各再灌注時間點(diǎn)比較變性、壞死的神經(jīng)元減少，空泡化改變減輕，組織間水腫減輕。

炎癥反應(yīng)是腦缺血再灌注損傷的重要因素，其最重要的功能是將白細(xì)胞輸送到損傷部位，而白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的粘附是白細(xì)胞浸潤的關(guān)鍵步驟。此過程的始動因素部分是由于在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞間粘附分子ICAM-1和其配基，在白細(xì)胞表面表達(dá)的整合素分子CD11/CD18糖蛋白相互作用而引起的。ICAM-1屬粘附分子中的免疫球蛋白超家族，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中細(xì)胞表達(dá)最廣泛的粘附分子，腦中幾乎所有的細(xì)胞如小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞均有ICAM-1的表達(dá)，但其在微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)最強(qiáng)［6］。正常情況下ICAM-1呈低表達(dá)，在感染、腦梗死等狀態(tài)下血清中ICAM-1含量出現(xiàn)顯著升高，尤其在急性腦梗死患者血清中ICAM-1增高程度與神經(jīng)功能缺損程度及梗死灶大小密切相關(guān)，故認(rèn)為ICAM-1含量變化反映出顱腦損傷程度［7］。動物實驗已經(jīng)證實:通過針對ICAM-1拮抗劑或抑制劑可以明顯減輕腦損傷后的腦水腫［8］。另外，抗ICAM-1抗體使腦缺血后缺血區(qū)損傷減少，并可明顯減小腦梗死面積及缺血區(qū)組織中多型核白細(xì)胞的數(shù)目，推遲缺血后炎癥發(fā)生的時間，并可明顯降低缺血區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)，目前，已經(jīng)有抗黏附分子單克隆抗體成功的用于實驗鼠治療腦缺血再灌注損傷，且收到良好的效果，并證明有神經(jīng)保護(hù)、減輕腦損傷的作用［9-10］。本實驗發(fā)現(xiàn)氟桂利嗪組再灌注3 h可見ICAM-1陽性表達(dá)，24 h逐漸增高。周華東等［11］研究大鼠大腦中動脈缺血2 h再灌注不同時間內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達(dá)發(fā)現(xiàn)，再灌注2 h ICAM-1開始升高，至48 h達(dá)到高峰，持續(xù)1周以上。

本實驗對氟桂利嗪組與高血糖組各再灌注時間點(diǎn)ICAM-1的表達(dá)情況進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)相同再灌注時間點(diǎn)氟桂利嗪組ICAM-1的表達(dá)比高血糖組減少，且兩者差異具有顯著性意義。說明鹽酸氟桂利嗪對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用與減少ICAM-1表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。有文獻(xiàn)報道高血糖在缺血早期可以引發(fā)大量的白細(xì)胞在缺血區(qū)的聚集，這是高血糖加重腦缺血損傷的原因之一［12］。生理狀態(tài)下，粘附分子只有低水平的表達(dá)，而在缺血期間其在內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)增加，這種反應(yīng)對白細(xì)胞粘附尤為重要，是促進(jìn)白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移的必要過程［13］。而有研究發(fā)現(xiàn)ICAM-1與整合素分子CD11/CD18作用后能引起白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加［14］，從而激活內(nèi)皮細(xì)胞，使ICAM-1表達(dá)上調(diào)，介導(dǎo)更多的白細(xì)胞粘附，形成正反饋過程。Barnett等［15］的實驗亦發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度能阻止ICAM-1mRNA表達(dá)上調(diào)。而鹽酸氟桂利嗪作為電壓依賴性鈣離子通道阻滯劑可以通過阻止病理條件下的Ca2+內(nèi)流，從而使ICAM-1表達(dá)減少。Etienne等［16］的實驗還觀察到ICAM-1能夠激活蛋白激酶c，催化ip3生成，引起細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)鈣庫釋放Ca2+，引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載。Ca2+作為第二信使能夠啟動多種反應(yīng)，包括引起細(xì)胞骨架修飾，進(jìn)一步使血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞間的連接松弛，以利于白細(xì)胞對缺血腦組織的趨化浸潤。綜上所述，鹽酸氟桂利嗪不僅可以阻止細(xì)胞內(nèi)鈣超載，而且可以抑制ICAM-1的表達(dá)，從而打斷了這種ICAM-1偶聯(lián)的Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，阻止白細(xì)胞在缺血區(qū)的聚集，起到腦保護(hù)的作用。

本研究無論是從組織形態(tài)還是從分子水平上，都證實了預(yù)防性應(yīng)用鹽酸氟桂利嗪對缺血前高血糖大鼠局部腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

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Effect of pretreatment by flunarizine hydrochlorid on focal cerebral ischemia reperfusion damage and the expression of ICAM-1 in rats with hyperglycemia

GAO Zheng1，JIANG Li-jie2，XING Yun-yun3，WANG Xu-gang1
(1.Department of Neurology，The North Hospital of Dalian Medical University No.2 Affiliated Hospital，Dalian 116031，China;2.Department of Neurology，Third People’s Hospital of Dalian，Dalian 116031，China;3.Department of Cardiology，F(xiàn)ourth People’s Hospital of Shenyang，Shenyang 110031，China)

［Objective］To investigate whether pretreatment with flunarizine hydrochlorid could relieve the injury of local cerebral ischemia-reperfusion in rats with hyperglycemia.［Method］Thirty six healthy male SD rats(weight from 180 g to 220 g)were randomly divided into 2 groups:hyperglycemia group(n=18)and flunarizine+hyperglycemia group(flunarizine group n=18).The rats in each group were divided into 3 subgroups according to reperfusion 3 h(n=6)，6 h(n=6) and 24 h(n=6)after ischemia for 90 minutes.The differences of cerebral pathological changes and the expressions of ICAM-1 among these groups.［Result］Compared with hyperglycemia group，the number of degenerative and necrosis neurons were less and tissue edema became was weaker.In the flunarizine group，the expression of ICAM-1 can be seen at 3 hours from reperfusion，and increase in 24 hours from reperfusion，P＜0.05.Compared with hyperglycemia group at every reperfusion time:ICAM-1 expressions were decreased in flunarizine group，P＜0.01.［Conclusion］The pretreatment of flunarizine hydrochlorid could decrease the expression of ICAM-1 and the focal ischemia-reperfusion damage of the ras with hyperglycemia.

flunarizine hydrochlorid;hyperglycemia;ischemia reperfusion;ICAM-1

Q95-33

A

1671-7295(2012)04-0339-04

2011-12-26;

2012-05-21

高政(1965-)，男，遼寧大連人，教授，主任醫(yī)師。E-mail:bygzyz@163.com