段 楓

多發(fā)性肌炎(polymyositis，PM)是一組以肌肉炎性改變?yōu)樘卣鳌⒊０橛屑±w維壞死變性的肌病。目前普遍認(rèn)為，PM是遺傳易感個(gè)體由于環(huán)境因素觸發(fā)引起的免疫介導(dǎo)過程，其發(fā)病機(jī)制尚未明了。纖溶系統(tǒng)是非常重要的細(xì)胞外基質(zhì)降解酶，通過降解細(xì)胞外基質(zhì)成分(extracellul-ar matrix，ECM)，在許多生理和病理過程中發(fā)揮重要作用，包括免疫和炎性反應(yīng)。特別是uPA系統(tǒng)，參與了巨噬細(xì)胞的增殖、黏附和遷移，被認(rèn)為在炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮了重要的作用。目前尚無uPA系統(tǒng)在PM、EAM發(fā)病機(jī)制中的作用方面的研究。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RT–PCR技術(shù)研究uPA、PAI-1基因mRNA在EAM和正常豚鼠肌肉組織中的表達(dá)，旨在探討纖溶酶原激活系統(tǒng)在EAM發(fā)病中的作用，為其治療提供線索。

1 材料與方法

1.1 試劑 兔肌球蛋白5 mg/0.5 ml、完全弗氏佐劑(美國(guó)sigma公司)、百日咳毒素(北京天壇生物制品所)、Trizol試劑盒(美國(guó)GibcoBRL公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Promega公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 25只健康雌性英國(guó)短毛豚鼠(符合二級(jí)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn))，重250～300 g，由解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為:(1)正常組10只，不進(jìn)行任何處理;(2)EAM組15只，按以下程序進(jìn)行EAM動(dòng)物模型誘導(dǎo)。兩組觀察到第4周末后，處死動(dòng)物，取血及肌肉標(biāo)本，做進(jìn)一步研究。

1.3 EAM 動(dòng)物模型誘導(dǎo) 取0.5 ml，10 μg/ml的兔肌球蛋白與等量福氏完全佐劑(CFA)混合制成1 ml抗原乳劑，分別于第0、7、14、21天背部皮下注射1次，同時(shí)于第0、7天給予百日咳毒素2 μg腹腔注射。EAM動(dòng)物模型成功標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)臨床評(píng)分、血肌酶變化及肌肉病理綜合判斷模型是否成功，模型成功的動(dòng)物進(jìn)行肌肉uPA和PAI-1基因mRNA表達(dá)的研究。

1.4 評(píng)價(jià)指標(biāo) 每次免疫注射后觀察豚鼠體重、免疫注射局部皮膚、步態(tài)、毛色、活躍度。根據(jù)動(dòng)物體重、姿勢(shì)、呼吸及活動(dòng)情況，以Lennon LA法評(píng)分。標(biāo)準(zhǔn):0分，無明顯的肌無力表現(xiàn);1分，無力咬嚙或鳴叫;2分，休息時(shí)隆起體位，頭下垂，前肢屈曲，行走震顫;3分，嚴(yán)重肌無力，不鳴叫，體重減輕，甚至肌肉萎縮，呼吸困難，瀕于死亡。癥狀居中者分別評(píng)分為0.5、1.5、2.5 分。

1.5 標(biāo)本制備 (1)動(dòng)物免疫成功后第4周末水合氯醛麻醉動(dòng)物后，活體取股四頭肌，分成兩部分，一部分樣本離體30 min內(nèi)置于液氮冷凍，隨后轉(zhuǎn)移入-80℃冰箱中保存，備做rt-PCR，另一部分新鮮肌肉標(biāo)本經(jīng)異戊烷-液氮速凍，行5 μm冷凍切片，HE染色，光鏡下觀察;(2)心臟取血，測(cè)定血肌酶(CK)。

1.6 uPA、PAI-1基因mRNA表達(dá)的測(cè)定

1.6.1 總RNA的提取和定量 取凍存的標(biāo)本各100 mg，分別加入1 ml Trizol溶液，提取總RNA，通過測(cè)定A260值和A280值分別計(jì)算RNA的濃度和純度，1180＜A260/A280＜2100。

1.6.2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(20 μl) 水 5 μl，加入總RNA 1 μg，混勻，在PCR 儀上保溫，70 ℃ 10 min，4 ℃ 5 min，依次加入M-MLV 5 緩沖液4 μl，dNTP混合物10 mM，2 μl，重組RNA 酶抑制藥0.5 μl，M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶200 U，隨機(jī)引物0.5 μg，加水至終體積20 μl并混勻，在PCR儀上保溫，25℃ 10 min，37 ℃ 120 min，99 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min，cDNA 模板-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR反應(yīng)體系10PCR 緩沖液10 μl，dNTP10 mM 2 μl，cDNA 模板4 μl，上游引物1 μg，下游引物1 μg，TaqDNA 聚合酶2.5 u，加水至終體積100 μl，混勻。反應(yīng)條件:uPA預(yù)變性94℃，5 min，變性94 ℃，0.5 min，退火53 ℃，0.5 ～1 min，延伸72 ℃ ，1 min，循環(huán)數(shù)27，終末延伸72℃，7 min。PAI-1:預(yù)變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃，0.5 min，退火52℃，0.5 ～1 min，延伸72 ℃1 min，循環(huán)數(shù)28，終末延伸72℃，7min。各引物根據(jù)Genebank合成。

uPA上游引物5'CCTACAATGCTCACAGATCCGATGC3'，下游引物 5'TCCACTGCCCCAGCTCACAA3'，PAI-1上游引物 5'AGCCCTCACTTGCCTCACCC3'，下游引物 5'CACTGATATTGAATCCCATAGCATCTT3'。

1.6.3 PCR產(chǎn)物相對(duì)定量 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，溴化乙啶染色，用凝膠掃描儀進(jìn)行電泳條帶強(qiáng)度分析。以GAPDH作為內(nèi)參照，將uPA/GAPDH，PAI-1/GAPDH的值作為各自表達(dá)水平的參數(shù)，在掃描儀上如未發(fā)現(xiàn)明顯條帶，則不按上述方法計(jì)算，作為陰性表達(dá)，參數(shù)計(jì)為0。

1.6.4 結(jié)果判定 有陽(yáng)性條帶作為陽(yáng)性表達(dá)，計(jì)算表達(dá)陽(yáng)性率;表達(dá)強(qiáng)度以相對(duì)灰度值表示:目的基因相對(duì)表達(dá)水平=(目的基因灰度值-背景灰度值)/(看家基因灰度值一背景灰度值)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)使用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本研究測(cè)定數(shù)值用±s表示，兩樣本均數(shù)比較用成組t檢驗(yàn)。兩變量間的相關(guān)分析用雙尾Pearson相關(guān)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EAM組發(fā)病情況 EAM組15只豚鼠免疫注射后兩周開始出現(xiàn)背部皮膚紅腫、破潰，2只豚鼠(5，14)免疫各周活動(dòng)正常，體重增長(zhǎng)，血肌酶正常，肌肉HE染色未見異常;13只動(dòng)物免疫2周后出現(xiàn)活動(dòng)減少，體重下降，其中2只豚鼠(7，11)分別于免疫第3、4周死亡，死亡后肌肉病理證實(shí)存在肌肉變性壞死及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，死亡原因考慮為肌炎導(dǎo)致的呼吸功能衰竭;其余11只豚鼠血肌酶明顯增高，肌肉HE染色可見炎性改變;15只動(dòng)物中有13只物模型成功，11只存活，模型成功率73.3%。正常組豚鼠各周活動(dòng)正常，體重增長(zhǎng)，血CPK值小于696.09 U/L。EAM組豚鼠的LennonLA評(píng)分變化及EAM組血清CK值見表1。EAM組的LennonLA評(píng)分與血CK顯著正相關(guān)(表1)。血CK是反應(yīng)EAM急性期疾病嚴(yán)重程度的客觀指標(biāo)。

2.2 肌肉病理形態(tài) 正常組及EAM組5、14號(hào)豚鼠肌肉HE染色(圖1A)，EAM組13只臨床發(fā)病的豚鼠(2只死亡)肌肉HE染色結(jié)果顯示，肌纖維大小不等、變性、壞死、萎縮，肌內(nèi)衣、肌束衣和間質(zhì)小血管周圍見淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1B、C、D)。

表1 EAM組L ennonLA評(píng)分及血CPK值

2.3 正常組和EAM肌肉上uPA、PAI-1基因mRNA的表達(dá) 本研究發(fā)現(xiàn)，正常組肌肉uPA 1.259±0.064、PAI-1基因mRNA表達(dá)水平1.13±0.080，EAM組肌肉uPA42.325±0.041、PAI-1基因mRNA表達(dá)水平2.055±0.037，EAM組肌肉uPA、PAI-1基因mRNA表達(dá)水平高于正常組(圖2)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。同時(shí)為了進(jìn)一步明確EAM發(fā)病機(jī)制中是否存在uPA/PAI-1失衡的問題，將正常組與EAM組uPA與PAI-1基因mRNA表達(dá)的比值(uPA/PAI-1)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，正常組uPA/PAI-1比值平均為1.10±0.023，EAM組uPA/PAI-1比值平均為1.114±0.017，兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

圖1 正常組及EAM組豚鼠肌肉HE染色

圖2 正常組和EAM肌肉上uPA、PAI－1基因mRNA的表達(dá)

3 討 論

uPA是一種絲氨酸蛋白酶，基因定位于10q24，分子量為54ku，以一種滅活的前體(pro-uPA)的形式分泌。在生理?xiàng)l件下，uPA主要來自于腎小管上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等，研究證實(shí)uPA也在多種哺乳動(dòng)物的肌纖維上表達(dá)。uPA可以與細(xì)胞表面特異性的細(xì)胞膜受體(uPAR)結(jié)合［1］，加速uPA前體在細(xì)胞表面轉(zhuǎn)化成為激活的uPA，使纖溶酶原激活，uPA和纖溶酶還可以通過激活MMP或者通過直接蛋白水解作用，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜中多種成分的降解參與炎性反應(yīng)［1，2］。此外uPA和uPAR還參與了炎性細(xì)胞的分化增殖、遷移和黏附［3-5］。由此可見，uPA系統(tǒng)在炎性過程中發(fā)揮著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)在肌肉損傷的模型中，uPA基因敲除小鼠肌肉損傷部位沒有巨噬細(xì)胞的聚集［6，7］。uPA參與了巨噬細(xì)胞的趨化性。此外在肌肉損傷模型中還發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性產(chǎn)生的uPA可以增加單核細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α［8］，這說明吞噬細(xì)胞來源的蛋白酶是導(dǎo)致炎性前(致炎信號(hào))產(chǎn)生的機(jī)制，uPA可能在肌肉炎性反應(yīng)中發(fā)揮了同樣的作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)uPA基因mRNA在EAM組肌肉中的表達(dá)水平高于正常組，提示uPA參與了EAM的發(fā)病。EAM肌肉組織uPA轉(zhuǎn)錄水平的高表達(dá)，可能與入侵肌肉局部的炎性細(xì)胞，以及內(nèi)源性單核巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生有關(guān)。一方面uPA通過直接或間接的ECM降解作用，破壞血管基底膜，促進(jìn)T細(xì)胞侵入肌組織，同時(shí)進(jìn)一步降解基底膜，使肌纖維完整性遭到破壞，出現(xiàn)肌纖維壞死和吞噬現(xiàn)象。另外，uPA可能通過參與肌肉炎性部位巨噬細(xì)胞的趨化、炎性前信號(hào)的產(chǎn)生、炎性細(xì)胞的激活分化和增殖促進(jìn)了EAM的發(fā)生。

纖溶酶原激活物抑制劑(PAI)是纖溶系統(tǒng)的重要組成成分，纖溶酶原活化系統(tǒng)(PAs)的主要的特異性抑制物。關(guān)于PAI在EAM中的作用可能具有雙重性。一方面，PAI-1是uPA活性以及纖溶酶產(chǎn)生的主要調(diào)節(jié)劑，PAI-1與uPA以1∶1比例形成復(fù)合物滅活uPA的活性，從而對(duì)纖溶系統(tǒng)、及纖溶酶原激活劑參與的細(xì)胞外基質(zhì)降解和信號(hào)傳導(dǎo)起到重要調(diào)節(jié)作用，通過調(diào)節(jié)血管外蛋白水解抑制炎性過程。研究發(fā)現(xiàn)PAI-1基因敲出小鼠，肌肉損傷部位的巨噬細(xì)胞聚集增加［9］，進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。另一方面，PAI-1可以與血漿和細(xì)胞外基質(zhì)的玻璃體結(jié)合蛋白、纖溶酶原激活劑及/受體(Upa/Upar)復(fù)合物結(jié)合，參與炎性細(xì)胞的黏附和脫離，從而促進(jìn)炎性的發(fā)生［10］。PAI-1還能與炎性及細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-6等相互作用，使炎性因子滲出增加促進(jìn)炎性的發(fā)生、發(fā)展［11］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在EAM組肌肉中PAI-1基因mRNA的表達(dá)高于正常組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示PAI-1參與了EAM的發(fā)病機(jī)制。PAI-1在轉(zhuǎn)錄水平上的高表達(dá)，一方面可能是炎性過程中uPA表達(dá)增加后的一個(gè)自身調(diào)節(jié)，從而保證uPA系統(tǒng)的穩(wěn)定，保證細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)定;但更重要的是它可能促進(jìn)了炎性的發(fā)生。筆者對(duì)正常組和EAM組之間uPA與PAI-1基因mRNA表達(dá)的參數(shù)比值進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，兩者沒有差異。這說明uPA、PAI-1基因mRNA表達(dá)的增加在EAM組沒有差異，這提示uPA/PAI-1系統(tǒng)的失衡并不是EAM發(fā)病的主要機(jī)制之一，如前所述，uPA/uPAR/PAI-1復(fù)合物的形成，參與炎性細(xì)胞的黏附和脫離，促進(jìn)了炎性反應(yīng)的發(fā)生，因此筆者推測(cè)在EAM發(fā)病機(jī)制中uPA/uPAR/PAI-1復(fù)合物的形成可能發(fā)揮了作用。

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