左瑋，王曉鋒，艾厚喜，張麗，季暉，陳乃宏，王

莫諾苷對(duì)二磷酸腺苷誘導(dǎo)兔血小板聚集后血栓素B2的影響

左瑋1,2，王曉鋒2,3，艾厚喜2，張麗2，季暉1，陳乃宏3，王文2

目的觀察莫諾苷對(duì)二磷酸腺苷(ADP)誘導(dǎo)兔血小板聚集后血栓素(TX)B2含量的影響。方法利用酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法(ELISA)試劑盒，檢測(cè)不同條件下ADP誘導(dǎo)血小板聚集后TXB2的含量。結(jié)果與對(duì)照組相比，莫諾苷能顯著抑制由ADP誘導(dǎo)兔血小板聚集后TXB2的升高(P＜0.001)。結(jié)論 莫諾苷可以不同程度抑制ADP誘導(dǎo)兔血小板聚集后TXB2的生成。

莫諾苷；血小板聚集；血栓素B2；兔

[本文著錄格式]左瑋，王曉鋒，艾厚喜，等.莫諾苷對(duì)二磷酸腺苷誘導(dǎo)兔血小板聚集后血栓素B2的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2012,18(4):329-330.

山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc)是山茱萸科植物，性微溫，味酸、澀，歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)益肝腎、澀精固脫的作用。環(huán)烯醚萜苷是本室研究得到的山茱萸有效成分。對(duì)山茱萸環(huán)烯醚萜苷進(jìn)一步分離，得到莫諾苷。前期研究發(fā)現(xiàn)，莫諾苷對(duì)SH-SY 5Y神經(jīng)細(xì)胞具有抗氧化、抗凋亡等保護(hù)作用[1-4]；莫諾苷能減小大鼠局灶性腦缺血再灌注模型腦梗死體積[5]，抑制皮層脂質(zhì)過(guò)氧化[6]。此外，莫諾苷能顯著抑制二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)、花生四烯酸(arachidonic acid,AA)和血小板活化因子(platelet-activating factor,PAF)誘導(dǎo)的兔血小板聚集的作用，尤其對(duì)ADP的抑制作用選擇性強(qiáng)[7]。血栓素(thromboxane, TX)A2是目前已發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的縮血管物質(zhì)與血小板聚集劑之一[8]。其穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物為T(mén)XB2。本文通過(guò)體外研究莫諾苷在ADP誘導(dǎo)血小板聚集后對(duì)TXB2含量的影響，進(jìn)一步從分子角度探討莫諾苷抗血小板聚集的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥物 莫諾苷由本室從山茱萸中提取制備，用高效液相分析，純度約98.5%；阿斯匹林(acetyl salicilic acid,ASA)為SIGMA公司產(chǎn)品，用時(shí)用蒸餾水溶解，以0.1mol/L NaHCO3調(diào)pH至7.0左右，再加蒸餾水稀釋到所需濃度。

1.2試劑 ADP：SIGMA公司，配制成7.5mg/m l儲(chǔ)存液，分裝，-20℃密封保存，臨用前稀釋，終濃度為10μmol/L；TXB2ELISA試劑盒(R&D)。

1.3動(dòng)物及儀器 新西蘭大耳白兔：體重(3.0±0.5) kg，SPF級(jí)，由北京開(kāi)源兔業(yè)養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖，合格證號(hào)SCXK(京)2006-0005；SC-2000 M icrofuge低溫離心機(jī)：美國(guó)BECK-MAN公司；IMT22型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(LP400型)：法國(guó)Diagnostic Pasteur公司。

1.4方法

1.4.1血小板的制備[9]2～3 kg雄性新西蘭大耳白兔，經(jīng)兔頸總動(dòng)脈取血，枸櫞酸鈉抗凝(1∶9)，230 g離心10 m in，取上清得富含血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)；PRP 800 g離心15m in，得血小板。

1.4.2負(fù)載血小板懸液的制備 配制無(wú)鈣Hepes buffer (Hepes 3.5 mmol,NaCl 137 mmol,KCl 2.7 mmol, NaH2PO43mmol,M gCl21mmol,pH7.4)和1mmol/L含鈣Hepes buffer(Hepes 3.5 mmol,NaCl 137 mmol,KCl 2.7 mmol,NaH2PO43 mmol,M gCl21 mmol,CaCl21 mmol,glucose 5mmol)。血小板經(jīng)無(wú)鈣Hepes buffer洗滌2次；再用1mmol/L含鈣Hepesbuffer重懸。

1.4.3加藥作用及離得樣品 上述制得的血小板樣品分別加入各藥品溶液，莫諾苷低、中、高劑量組分別為3.0mg/m l、6.0mg/m l、12.0mg/m l；對(duì)照組加生理鹽水；陽(yáng)性藥選擇ASA(ASA組)，0.5mg/m l。體外作用5 m in；加ADP(10μmol/L)聚集5 m in；然后加入EDTA(2mmol/L)和消炎痛(Indomethacin,50μmol/L)終止炎癥反應(yīng)；最后14000 r/m in離心2m in，取得上清用于測(cè)定TXB2的含量。

按TXB2ELISA試劑盒(R&D)操作[10]，每組5份。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。組間樣本均數(shù)比較用單因素方差分析，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

與對(duì)照組相比，ASA組顯著抑制血小板聚集TXB2的產(chǎn)生，抑制率達(dá)到70%左右。表明血小板聚集功能正常，而ASA可以很強(qiáng)地抑制血小板聚集引起的TXB2含量的升高。與對(duì)照組相比，莫諾苷的低、中、高組可劑量依賴性降低ADP誘導(dǎo)血小板聚集引起TXB2含量的升高，低劑量組(3mg/m l)就開(kāi)始起效(抑制率達(dá)30%左右)。見(jiàn)表1。

表1 莫諾苷對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集TXB2含量的影響

3 討論

心腦血管疾病發(fā)病率不斷升高，給社會(huì)和國(guó)家?guī)?lái)巨大的負(fù)擔(dān)，抗血小板聚集藥物在防治心腦血管疾病過(guò)程中起著重要作用。常用抗血小板聚集藥物阿司匹林在預(yù)防腦卒中和急性心肌梗死方面發(fā)揮著不可替代的作用，但長(zhǎng)期服用容易造成胃潰瘍、腎炎以及精神障礙等疾病。因此，篩選一種選擇性高、作用強(qiáng)、可逆轉(zhuǎn)、副作用小的口服抗血小板聚集藥物，是未來(lái)的必然趨勢(shì)。中藥治療心腦血管疾病歷史悠久。20世紀(jì)50年代以后，采用活血化瘀法治療心腦血管疾病等取得了引人注目的進(jìn)展?；钛鲋兴幏絼┓乐窝苄约膊〉淖饔脵C(jī)制主要為防治血栓形成和改善血液循環(huán)。研究活血化瘀中藥的活性成分，進(jìn)而開(kāi)發(fā)出新藥，是中藥現(xiàn)代化研究的課題。一些單體化合物及有效成分在抗血小板聚集方面的作用也得到研究證實(shí)，如銀杏內(nèi)酯、姜黃酮、丹酚酸及人參皂苷等均有很好的作用。血小板聚集功能在生理性止血以及病理性血栓形成中起著重要的作用。

目前已知血小板的聚集反應(yīng)至少通過(guò)ADP、TXA2和PAF等3條途徑激活，而各種誘導(dǎo)劑如ADP、AA、PAF等均可通過(guò)上述不同途經(jīng)激活血小板聚集。在前期的研究中，我們初步觀察了莫諾苷可以不同程度抑制ADP、AA、PAF誘導(dǎo)的兔血小板聚集，尤其是對(duì)ADP誘導(dǎo)的兔血小板聚集有較好的選擇性。血小板與血管壁接觸時(shí)合成和釋放TXA2并促進(jìn)血小板聚集。由于TXA2的半衰期很短，目前難以直接測(cè)定，故國(guó)內(nèi)外一般將TXA2穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物TXB2作為判斷其濃度的指標(biāo)。本文著重通過(guò)測(cè)定莫諾苷是否能夠抑制ADP誘導(dǎo)后TXB2的生成，探討莫諾苷抑制血小板聚集的可能機(jī)制。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)看，莫諾苷可以不同程度抑制ADP誘導(dǎo)兔血小板聚集后TXB2的生成。從分子機(jī)制證明，莫諾可能通過(guò)減少TXB2的含量，抑制兔血小板聚集。但是體內(nèi)抗凝機(jī)制十分復(fù)雜，涉及多種因素，因此對(duì)于莫諾苷抗凝機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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Effects of M orroniside on Inhibiting Throm boxane B2after Platelet Aggregation Induced by Adenosine Diphosphate in Rabbits

ZUOWei,WANG Xiao-feng,AIHou-xi,etal.China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,Jiangsu,China

Ob jectiveTo study the effects ofmorroniside on thromboxane B2in the condition of platelet aggregation in rabbits induced by adenosine diphosphate(ADP).M ethodsThe level of TXB2was determ ined by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Resu ltsCom pared w ith the controls,morroniside significantly inhibited the increase of TXB2induced by ADP(P＜0.001).ConclusionM orroniside can inhibit the levelof TXB2by inhibiting the plateletaggregation in rabbits induced by ADP.

morroniside;plateletaggregation;thromboxane B2;rabbits

R285.5

A

1006-9771(2012)04-0329-02

2011-08-05)

1.“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(2009ZX 09103-366)；2.國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30973893)；3.北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(7102077)；4.北京市教委(PXM 2011_014226_07_000071)；5.2011年北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才。

1.中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇南京市210009；2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，北京市100053；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所，北京市100050。作者簡(jiǎn)介：左瑋(1986-)，女，河北保定市人，碩士研究生，主要研究方向：神經(jīng)藥理、中藥藥理。通訊作者：季暉。

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.04.004