郭蕾蕾，張宏，田國(guó)慶，梁曉春

中藥筋脈通對(duì)高糖培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)的影響①

郭蕾蕾1a，張宏1b，田國(guó)慶1a，梁曉春1a

目的探討中藥筋脈通含藥血清對(duì)高糖培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用。方法采用血清藥理學(xué)方法制備筋脈通含藥血清(JMT)，原代培養(yǎng)新生鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞分別接種于不同條件的培養(yǎng)基中，分為正常對(duì)照組、高糖組、陽(yáng)性對(duì)照組以及JMT大、中、小劑量組。不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后使用Western blotting檢測(cè)其Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達(dá)。結(jié)果與正常對(duì)照組相比，高糖組Caspase-3、Bax表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，Bcl-2的表達(dá)下降(P＜0.05)；與高糖組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和JMT各劑量組的Caspase-3、Bax表達(dá)明顯下降(P＜0.01)，Bcl-2的表達(dá)升高(P＜0.05)；與陽(yáng)性對(duì)照組相比，JMT各劑量組的Caspase-3、Bax表達(dá)下降(P＜0.05)，筋脈通大、中劑量組Bcl-2的表達(dá)增加(P＜0.05)。結(jié)論筋脈通含藥血清可能通過(guò)提高Bcl-2蛋白的表達(dá)，減少Bax、Caspase-3的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2/Bax的比值，從而減少海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。

糖尿??；認(rèn)知功能障礙；筋脈通；海馬神經(jīng)元；Bax；Bcl-2；Caspase-3

[本文著錄格式]郭蕾蕾，張宏，田國(guó)慶，等.中藥筋脈通對(duì)高糖培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2012,18(4):324-328.

隨著糖尿病發(fā)病率的逐年增加，糖尿病導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶功能障礙日益受到人們的重視。一方面，糖尿病可明顯增加癡呆的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，包括血管性癡呆(vascular dementia,VD)和阿爾茨海默病(A lzheimer's Disease,AD)；另一方面，糖尿病可以導(dǎo)致患者輕、中度認(rèn)知功能的下降，表現(xiàn)為輕、中度學(xué)習(xí)、記憶和執(zhí)行能力的下降[1]。多種因素參與糖尿病認(rèn)知功能下降的復(fù)雜病理過(guò)程，其中高血糖對(duì)腦神經(jīng)元的影響是不可忽略的重要因素[2]，而與學(xué)習(xí)記憶活動(dòng)關(guān)系密切的海馬更容易受到血糖水平的影響[3]。中藥筋脈通膠囊是北京協(xié)和醫(yī)院的內(nèi)部制劑，長(zhǎng)期應(yīng)用于臨床，對(duì)糖尿病及其周圍神經(jīng)病變等慢性并發(fā)癥具有較好的療效[4]。本實(shí)驗(yàn)以原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞為靶細(xì)胞，觀察筋脈通含藥血清對(duì)高糖環(huán)境下海馬神經(jīng)元相關(guān)凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)的影響，以期探討中藥筋脈通對(duì)高糖培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物 出生24 h SD新生鼠15只，體重約4～6 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司，合格證號(hào)：SCXK(京)2009-2007。SD雄性大鼠38只，體重280～320 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可號(hào)：SCXK(京)2007-0001。

1.2主要試劑與藥品 DMEM高糖培養(yǎng)基(北京協(xié)和細(xì)胞資源中心)；優(yōu)質(zhì)胎牛血清(characterized fetalbovine serum,FBS)、0.25%胰蛋白酶+0.03%EDTA(Hyclone)；多聚左旋賴氨酸(polylysine,PLL)(SIGMA)；神經(jīng)元生長(zhǎng)因子(nerve grow th factor,NGF)(Invirtogen)；FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(中杉金橋)；兔抗鼠Enolase(NSE)、activated Caspase-3、Bcl-2、Bax多克隆抗體(Bioworld)；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(Jackson)；兔抗鼠β-actin多克隆抗體(Santa cruz)；Caspase抑 制劑 Z-VAD-FMK(碧 云 天)； 即 用 型 Annexin-V-FLUOS試劑盒(Roche)；PVDF膜，0.45μm孔徑(M illipore)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天)；SDS (SIGMA)；ECL發(fā)光液(M illipore)；筋脈通膠囊(由菟絲子、女貞子、水蛭、延胡索、桂枝、細(xì)辛等組成)，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院院內(nèi)制劑，由北京九龍制藥廠加工生產(chǎn)，每粒含生藥0.35 g，批準(zhǔn)文號(hào)(97)京衛(wèi)藥制加字[48]第F-292號(hào)，生產(chǎn)批號(hào)：061019。

1.3主要儀器與設(shè)備 ALC PK 121R高速低溫離心機(jī)；Thermo Fresco低溫冷凍離心機(jī)；Forma 3111 CO2培養(yǎng)箱；Olympus CKX31SF倒置相差顯微鏡；Leica TCSSP2SE激光掃描共聚焦顯微鏡；M illipore Advantage A 10超純水系統(tǒng)；Thermo M ultiSkanMK 3酶標(biāo)儀；Cavoy M iniP-4電泳槽；Cavoy濕轉(zhuǎn)電泳槽；Bio-Rad電泳儀。

2 方法

2.1含藥血清及正常大鼠血清的制備 SPF級(jí)雄性SD大鼠38只，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組(n=28)和筋脈通組(n=10)。適應(yīng)性喂養(yǎng)24 h后開(kāi)始灌胃。筋脈通組按成人劑量的15倍給藥(即1.3125 g/kg?d)，正常組給予同等體積的蒸餾水。每天灌胃2次，連續(xù)3 d。于末次灌胃后2 h內(nèi)頸動(dòng)脈取血，采集的全血室溫靜置2 h后，4℃ 4000 r/m in離心10 m in，分離血清，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆?，避免反?fù)凍融。使用時(shí)56℃水浴滅活30m in，0.22μm濾器過(guò)濾，用正常大鼠血清分別按0∶1、1∶2、2∶1的比例稀釋筋脈通含藥血清即得筋脈通大、中、小劑量含藥血清。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)液的配制 DMEM完全培養(yǎng)基：180m l DMEM高糖培養(yǎng)基中分別加入FBS(終濃度10%)、谷氨酰胺(2 mmol/L)，丙酮酸鈉(1 mmol/L)，Hepes(20 mmol/L)，雙抗(青霉素100 U/m l，鏈霉素100μg/ m l)，NGF(10 ng/m l)。置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基：除不加FBS外，余與DMEM完全培養(yǎng)基的配制相同。

2.3實(shí)驗(yàn)分組 使用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞至第3天時(shí)，更換為不同條件的培養(yǎng)基。各組培養(yǎng)基均含DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基，其中正常對(duì)照組(NC)另加10%正常血清，其余各組均加50mmol/L葡萄糖，高糖組(HG)另加10%正常大鼠血清，陽(yáng)性對(duì)照組(PC)另加10%正常血清和10mmol/m l Z-VAD-FMK，JMT大劑量組(JH)、中劑量組(JM)、小劑量組(JL)分別另加入10%筋脈通大、中、小劑量含藥血清。

2.4海馬神經(jīng)元的分離、純化與培養(yǎng) 出生24 h SD新生鼠，75%酒精浸泡5 m in，取出后置-20℃約3～5 m in，分離腦內(nèi)兩側(cè)海馬組織；用D-Hank's液沖洗2次后將組織剪碎至0.5～1.0mm，加入濃度為0.25%胰蛋白酶37℃消化約20m in；觀察液體呈一定懸濁度即加入FBS終止消化，用200目細(xì)胞篩過(guò)篩，收集細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液小心加入15m l離心管中淋巴細(xì)胞分離液(與細(xì)胞懸液的比例1∶1.6)的上層，2000 r/m in離心20m in，收集細(xì)胞層細(xì)胞；用D-Hank's液重懸細(xì)胞，1500 r/m in再次離心5 m in；棄上清，用DMEM完全培養(yǎng)基30m l重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按一定的細(xì)胞密度接種于PLL包被的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中。

2.5海馬神經(jīng)元的鑒定 將細(xì)胞懸液以5×105細(xì)胞/孔的濃度接種到預(yù)先放置了蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至第3天取出蓋玻片進(jìn)行免疫熒光鑒定，共聚焦激光顯微鏡檢測(cè)NSE的表達(dá)，檢測(cè)步驟如下：①取出蓋玻片，0.01M PBS浸洗后加入4℃預(yù)冷的4%多聚甲醛常溫固定1 h；②0.01M PBS漂洗3次×2m in，加入0.1% Triton-X 100浸泡10 m in；③0.01 M PBS清洗3次×2 m in，加入山羊血清封閉液與非特異性蛋白結(jié)合，室溫孵育20m in；④加入一抗即兔抗鼠NSE多克隆抗體(1∶10)，濕盒內(nèi)37℃孵育1 h，陰性對(duì)照組以0.01M PBS代替一抗；⑤0.01 M PBS清洗3次×2m in，加入FITC偶聯(lián)山羊抗兔IgG(1∶50)，37℃濕盒避光孵育1 h；⑥0.01 M PBS振洗6次×5m in，加入DAPI工作液封片；⑦使用共聚焦激光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)，所攝圖像以Leica Confocal圖像分析軟件分析，每組計(jì)數(shù)15～20個(gè)細(xì)胞。

2.6Western blotting檢測(cè)Bcl-2、Bax、Caspase蛋白表達(dá) ①蛋白樣品的制備：待檢測(cè)的各組細(xì)胞樣本加入預(yù)冷RIPA裂解液，冰上孵育20 m in，13000 r/m in，4℃離心，20m in，取上清；按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒的使用方法，計(jì)算出各組蛋白濃度；補(bǔ)充RIPA調(diào)整各組蛋白濃度。②SDS-PAGE電泳：根據(jù)目的蛋白的分子量，制備10%分離膠和5%濃縮膠；蛋白樣品中加入等量2×SDS-PAGE加樣緩沖液，于100℃加熱5m in使蛋白充分變性；冷卻樣品后，按順序?qū)⑻幚砗玫臉悠芳尤霛饪s膠加樣孔內(nèi)，樣品15μl/孔，marker 3μl/孔，以SDS-PAGE電泳進(jìn)行蛋白分離。③轉(zhuǎn)膜：使用濕轉(zhuǎn)法將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)膜效果；對(duì)照marker，剪出膜上的目的蛋白及內(nèi)參蛋白β-actin的條帶。④封閉：將膜完全浸泡于3%BSA-TBST中，搖床上室溫封閉30 m in，TBST洗膜。⑤一抗孵育：分別加入1∶1000稀釋的一抗即兔抗鼠Caspase-3、Bcl-2、Bax多克隆抗體，搖床上室溫輕搖40m in后，4℃孵育過(guò)夜。⑥二抗孵育：TBST漂洗膜后，加入1∶1000稀釋的二抗即HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)，搖床室溫孵育40 m in，TBST漂洗。⑦蛋白檢測(cè)：將ECL發(fā)光液加到膜上后反應(yīng)3～5 m in，膠片曝光10 s～5 m in，顯影2 m in，定影，所攝圖像以LabWorks 4.6圖像分析軟件分析，記錄各組目的蛋白及內(nèi)參蛋白的灰度掃描值，每組重復(fù)3次。

2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)采用(±s)描述，行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，顯著性水平α=0.05。

3 結(jié)果

3.1海馬神經(jīng)元形態(tài) 倒置相差顯微鏡下觀察，剛接種的海馬神經(jīng)元胞體呈圓形，體積小，折光性強(qiáng)，分布均勻；培養(yǎng)1 d后，大部分細(xì)胞伸出三四個(gè)短小的突起，其中有些細(xì)胞發(fā)生再聚合現(xiàn)象，細(xì)胞幾乎全部貼壁；生長(zhǎng)4 d后，神經(jīng)元細(xì)胞體進(jìn)一步增大，突起進(jìn)一步增多并明顯增長(zhǎng)，連接形成稀疏的網(wǎng)絡(luò)，神經(jīng)元以多極神經(jīng)元為主；培養(yǎng)7 d后，細(xì)胞體積繼續(xù)增大，胞體飽滿，突起增粗增長(zhǎng)，分支增多，形成致密的網(wǎng)絡(luò)。見(jiàn)圖1。

圖1 培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)

3.2海馬神經(jīng)元鑒定及純度 培養(yǎng)3 d的細(xì)胞，NSE免疫熒光染色，胞漿和突起被染成綠色而胞核不被染色的為陽(yáng)性細(xì)胞，所有細(xì)胞的胞核均被染成藍(lán)色。見(jiàn)圖2。

在共聚焦激光掃描顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照，以3個(gè)視野中陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)目占總細(xì)胞的比例為神經(jīng)元純度，經(jīng)鑒定神經(jīng)元純度達(dá)90%以上。

3.3Western blotting檢測(cè)各組Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達(dá) 各組內(nèi)參蛋白β-actin的表達(dá)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；與NC組相比，HG組Caspase-3、Bax表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，Bcl-2的表達(dá)下降(P＜0.05)，Bcl-2/ Bax的比值下降(P＜0.05)；與HG組相比，PC組和筋脈通各劑量組的Caspase-3、Bax表達(dá)均明顯下降(P＜ 0.01)，Bcl-2的表達(dá)升高(P＜0.05)，Bcl-2/Bax的比值升高(P＜0.05)；與PC組相比，筋脈通各劑量組的Caspase-3、Bax表達(dá)下降(P＜0.05)，JH和JM組Bcl-2的表達(dá)增加(P＜0.05)，JL組Bcl-2的表達(dá)與PC組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；筋脈通各劑量組之間相比，JH、JM、JL三組Caspase-3表達(dá)均具有顯著性差異(P＜0.05)，Bcl-2/Bax的比值在三組間呈下降趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。各組內(nèi)參蛋白β-actin與目的蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2的灰度掃描值以及Bcl-2/Bax的比值見(jiàn)表1。

各組Caspase-3、Bax、Bcl-2和β-actin的Western blotting化學(xué)發(fā)光免疫印跡見(jiàn)圖3。

表1 Western b lotting檢測(cè)Caspase-3、Bax、Bcl-2、Bcl-2/Bax的表達(dá)

圖2 培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元(NSE免疫熒光染色，200×)

圖3 各組Caspase-3、Bax、Bcl-2和β-actin Western blotting

4 討論

海馬組織是中樞神經(jīng)系統(tǒng)維持完整的學(xué)習(xí)和記憶功能的重要結(jié)構(gòu)，對(duì)血糖代謝平衡的變化尤其敏感。基于像素的形態(tài)學(xué)測(cè)量(voxel-based morphometry, VBM)分析腦磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)顯示，糖尿病可導(dǎo)致海馬體積的明顯萎縮[5-7]。同時(shí)海馬組織也是糖尿病患者大腦最先受累的結(jié)構(gòu)，海馬相關(guān)的記憶(近期或陳述性)缺陷也是最先受損的認(rèn)知功能[6-7]。由于腦MRI所反應(yīng)海馬體積與實(shí)際神經(jīng)元數(shù)量的體積是等價(jià)的[8]，因此，MRI示海馬體積的下降顯示了海馬神經(jīng)元的丟失。另外，研究發(fā)現(xiàn)海馬體積的萎縮程度與糖化血紅蛋白、糖尿病病程呈正相關(guān)，血糖控制不良的患者海馬體積下降更明顯[6,9-10]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，持續(xù)性高血糖可引起海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)元密度下降[11-12]?？梢酝茢啵哐且鸬暮ｑR神經(jīng)元凋亡必然參與了糖尿病認(rèn)知功能障礙的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

目前糖尿病認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)制并不明確，一般認(rèn)為，高血糖引起的大腦缺血改變、氧化應(yīng)激、非酶性蛋白糖基化、鈣離子穩(wěn)態(tài)的改變等是其中不可忽略的重要因素[13]。K lein和Waxman詳細(xì)分析了糖尿病時(shí)神經(jīng)元的分子改變，認(rèn)為以上因素雖然可造成神經(jīng)元的損傷，神經(jīng)元基因表達(dá)的改變可能是糖尿病認(rèn)知功能障礙新的發(fā)病機(jī)制[14]。細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主的有序性死亡，涉及一系列基因激活、表達(dá)以及調(diào)控等主動(dòng)過(guò)程。其中，Caspase被認(rèn)為是一切凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路，Caspase-3是凋亡的主要執(zhí)行者，是Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中關(guān)鍵的效應(yīng)蛋白酶，一旦被激活，凋亡常難以避免[15]。Bcl-2家族在凋亡細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)中起著重要作用，抗凋亡Bcl-2與促進(jìn)凋亡的Bax具有高度同源性，可形成異源二聚體，兩者之間比例的平衡可決定凋亡是否發(fā)生[16]。目前認(rèn)為，Bax和Bcl-2蛋白可通過(guò)抑制細(xì)胞色素C的釋放和Caspase的激活來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)高糖環(huán)境下海馬神經(jīng)元細(xì)胞中Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HG組較NC組Caspase-3、Bax的表達(dá)明顯增加，而Bcl-2的表達(dá)下降，導(dǎo)致Bcl-2/Bax比值下降。說(shuō)明高糖可通過(guò)調(diào)節(jié)Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)海馬神經(jīng)元的凋亡。此結(jié)果與Stranahan、Norman等[11-12]的研究結(jié)果類似?？梢酝茢啵咛强赡苁峭ㄟ^(guò)降低Bcl-2/Bax的比值達(dá)到一定“閾值”后，充分激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Caspase抑制劑Z-VAD-FMK是一種可以穿過(guò)細(xì)胞膜的泛Caspase抑制劑，可以抑制Caspase激活導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡[17]。本實(shí)驗(yàn)使用Caspase-3抑制劑Z-VAD-FMK的陽(yáng)性對(duì)照組和筋脈通各劑量組中Caspase-3、Bax的表達(dá)較高糖組明顯下降，并且Bcl-2的表達(dá)升高，Bcl-2/Bax的比值升高，且筋脈通各劑量組對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用顯著優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組并且呈一定濃度依賴性趨勢(shì)。提示Caspase-3抑制劑和筋脈通含藥血清對(duì)高糖環(huán)境下海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用可能是通過(guò)提高Bcl-2/Bax的比值，抑制Caspase-3的激活實(shí)現(xiàn)的；并且筋脈通含藥血清對(duì)凋亡蛋白的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于Caspase-3抑制劑Z-VAD-FMK。

糖尿病認(rèn)知功能障礙屬于中醫(yī)消渴病合并“呆癥”、“健忘”的范疇，《圣濟(jì)總錄》中有“消渴日久，健忘怔忡”等認(rèn)知功能損害的癥狀記載?！夺t(yī)學(xué)心悟》中有“腎主智，腎虛則智不足”之說(shuō)，因此學(xué)習(xí)記憶障礙患者多有腎虛。另外，現(xiàn)代研究證實(shí)糖尿病患者多有血瘀[18]。故消渴呆癥的基本病機(jī)為腎虛血瘀，絡(luò)脈不通。因此，補(bǔ)腎活血通絡(luò)是治療糖尿病性認(rèn)知功能障礙的根本大法。筋脈通主要由菟絲子、女貞子、水蛭、延胡索、桂枝、細(xì)辛等組成。菟絲子、女貞子歸肝、腎經(jīng)，兩者配伍滋陰益腎，陰陽(yáng)俱補(bǔ)；水蛭歸肝經(jīng)，具破血逐瘀之功，與女貞子、菟絲子配伍使得補(bǔ)腎與活血并行，祛邪而不傷正；延胡索性溫，主要作用是活血化瘀、行氣止痛，與水蛭同用加強(qiáng)活血化瘀的功效；桂枝、細(xì)心皆入肺、腎、心經(jīng)，溫陽(yáng)通絡(luò)，諸方共奏補(bǔ)腎養(yǎng)陰活血通絡(luò)之效，符合糖尿病認(rèn)知功能障礙的病機(jī)。同時(shí)，筋脈通組方中的齊墩果酸、香豆素、水蛭素、桂皮醛、細(xì)辛醚、黃酮類、苷類、生物堿類等單體或有效成分具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用。由此推斷，筋脈通對(duì)高糖培養(yǎng)海馬神經(jīng)元凋亡可能具有一定的保護(hù)作用。至于筋脈通在體內(nèi)環(huán)境下的作用及其確切機(jī)制尚有待于進(jìn)一步的研究和探討。

致謝

感謝中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所劉玉琴教授對(duì)本論文寫作上的幫助。

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Effects of Jinm aitong on Exp ression of Bax,Bcl-2 and Caspase-3 in H ippocam pal Neurons Cu ltured w ith H igh G lucose

GUO Lei-lei,ZHANG Hong,TIAN Guo-qing,et al.Peking Union Medical College Hospital and Institute of Basic Medical Sciences,Peking Union Medical College,Chinese Academy ofMedical Sciences,Beijing 100730,China

Ob jectiveTo explore the effectof Jinmaitong(JMT)on expression of Bax,Bcl-2 and Caspase-3 in hippocampalneurons cultured w ith high glucose.M ethodsHippocam pal neuronsw ere primarily cultured and purified from the hippocampus of new-born Sprague Daw ley rats.Neuron-specific enolase immunocytochem icalmethod was adopted for the identification of the neurons.They were divided into normal controlgroup,high glucose group,high-dose JMT(JH)group,m iddle-dose JMT(JM)group,low-dose JMT(JL)group and a positive control group.72 hours later,Western blotting was adopted to detect the expression of Bax,Bcl-2 and Caspase-3.Resu ltsCompared w ith the normal control group,the expression of Bax and Caspase-3 in the high glucose group significantly increased(P＜0.01),and the expression of Bcl-2 significantly decreased(P＜0.05).Compared w ith the high glucose group,the expression of Caspase-3 and Bax in the positive control group and JH,JM,and JL groups significantly decreased(P＜0.01),and the expression of Bcl-2 significantly increased(P＜0.05). Com pared w ith the positive control group,the expression of Caspase-3 and Bax significantly decreased in JH,JM,and JL groups(P＜0.05), and the expression of Bcl-2 significantly increased in JH and JM groups(P＜0.05).ConclusionJMTmay reduce apoptosis by inhibiting the expression of Bax and Caspase-3 and promoting the expression of Bcl-2.

diabetesmellitus;cognitive dysfunction;Jinmaitong;hippocampalneurons;Bax;Bcl-2;Caspase-3

R285.5；R587.1

A

1006-9771(2012)04-0324-05

2012-02-13)

首都醫(yī)學(xué)發(fā)展科研基金項(xiàng)目(SF-2009-Ⅲ-29)。

1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，a：北京協(xié)和醫(yī)院；b：基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京市100730。作者簡(jiǎn)介：郭蕾蕾(1986-)，女，山東臨沂市人，碩士研究生，主要研究方向：糖尿病及其慢性并發(fā)癥和肺癌的中西醫(yī)防治。通訊作者：田國(guó)慶。

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.04.003