王 靜，王海芳，花立民，馬喜迎，王亮亮

（1.蘭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅省小隴山林業(yè)實驗局，甘肅 天水 741020）

裸果木（Gymnocarpos przewalskii）隸屬石竹科（Caryophyllaceae）裸果木屬（Gymnocarpos），主要分布在新疆南部山區(qū)、甘肅河西走廊、青海西部、內(nèi)蒙古西部、寧夏東南部（沙坡頭地區(qū)）［1］。裸果木是古地中海荒漠殘遺種，屬于珍稀植物，為1987年我國首批公布的國家二級保護植物，1997年被定為一級保護植物。對研究我國西北和內(nèi)蒙古荒漠的發(fā)生、發(fā)展、氣候變化及旱生植物區(qū)系成分的起源有著非常重要的科學(xué)價值［2］。近年來，由于生存環(huán)境的惡化，及自身生物學(xué)因素，又遭樵采和駱駝啃食等人類各種經(jīng)濟活動的干擾和破壞，裸果木的種群數(shù)量急劇減少，分布區(qū)已日益縮小和片段化［3］。開展種群遺傳學(xué)研究，制定相關(guān)的保護計劃，是保護其的有效途徑。

目前有關(guān)裸果木的相關(guān)研究主要集中在形態(tài)解剖學(xué)［4，5］、生理生態(tài)［6－8］、組織培養(yǎng)和擴繁［9］以及化學(xué)成分研究［10］等方面，有關(guān)分子水平的研究較少。隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）技術(shù)是以PCR為基礎(chǔ)的一種分子標(biāo)記，具有操作簡便、快速、低成本、多態(tài)性檢出率高等優(yōu)點［11］，在遺傳多樣性評價、物種分類與鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建等方面有廣泛的應(yīng)用［12，13］，由于RAPD引物的隨機性及較低的退火溫度等導(dǎo)致的條件不穩(wěn)定等，影響了該技術(shù)的應(yīng)用。在應(yīng)用該技術(shù)時，通常需要對其反應(yīng)體系進行優(yōu)化，以提高其穩(wěn)定性。為此進行了裸果木RAPD體系的構(gòu)建和優(yōu)化試驗，為開展裸果木種質(zhì)資源保護和管理提供有價值的科學(xué)參考。

1 材料和方法

1.1 材料

自2008～2009年10月，采集了甘肅省肅北縣紅柳峽口子干溝一帶裸果木葉片若干。

成立護理質(zhì)量綜合評價指標(biāo)體系課題小組，護理部主任負責(zé)小組主持工作，小組成員包括3名護理質(zhì)量管理專家、2名信息工程師、3名臨床護士長、3名護理骨干共11人；小組主要任務(wù)為提煉護理質(zhì)量敏感指標(biāo)、組織專家進行指標(biāo)咨詢及篩選、構(gòu)建護理質(zhì)量控制指標(biāo)體系并嵌入護理信息系統(tǒng)、推進以指標(biāo)監(jiān)測為主線的護理質(zhì)量控制。

試劑40個10bp大小的RAPD隨機引物、Taq酶、10×Taq緩沖液、Mg2＋、dNTP均購自大連寶生物有限公司；瓊脂糖、DNA Marker等均購自天為時代科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 裸果木DNA提取及濃度、純度檢測 DNA提取按改良CTAB法進行［14］。在紫外分光光度計上，檢測DNA樣品的濃度和純度。

2.2.3 RAPD反應(yīng)體系的穩(wěn)定性檢測結(jié)果 以不同裸果木個體為實驗材料，以多態(tài)性較好的引物（0～24），對建立的反應(yīng)體系的穩(wěn)定性進行檢驗，所選擇的引物可以擴增出清晰、重復(fù)性好的條帶，初步表明優(yōu)化的體系及反應(yīng)參數(shù)是穩(wěn)定可靠的（圖8）。

我們黨是一個敢于堅持真理，勇于修正錯誤的黨。我們黨在改革開放的過程中逐漸認識到，要高度重視人民利益，高度重視人民生活的改善，堅決破除一切不合時宜的思想觀念和阻礙國家民族發(fā)展的一切體制機制障礙，讓一切創(chuàng)造社會財富的源泉充分涌流。貧窮不是社會主義，人民幸福是社會主義優(yōu)越性的本質(zhì)體現(xiàn)。

Client/Server架構(gòu)的數(shù)據(jù)庫，可根據(jù)Client查詢請求返回相應(yīng)的結(jié)果集，避免了在網(wǎng)絡(luò)上傳播無效數(shù)據(jù)，有效地利用了網(wǎng)絡(luò)帶寬，提高了系統(tǒng)性能。本系統(tǒng)采用了流處理機制(Stream)對數(shù)據(jù)集對象(ADO)序列化和反序列化，利用AdoDataSet數(shù)據(jù)集SaveToFile方法將數(shù)據(jù)集保存到文件中，再通過內(nèi)存流(Mem?oryStream)緩存在內(nèi)存中，使用ZIP壓縮算法在壓縮內(nèi)存流中的數(shù)據(jù)后返回給Client，Client收到響應(yīng)數(shù)據(jù)后進行反序列化即可還原出該數(shù)據(jù)集對象(ADO)。由于網(wǎng)絡(luò)上傳輸?shù)臄?shù)據(jù)是經(jīng)過壓縮的，進一步提高了系統(tǒng)性能。

對于政府在“河長制”這一政策的宣傳力度上，認為“一般，宣傳效果只針對相關(guān)工作人員”的公眾占比半數(shù)以上，其次是“不滿意，周圍人很少關(guān)注政策內(nèi)容及實施效果”，而公眾認為“滿意，宣傳到位且形式多樣”的占比較少，值得關(guān)注的是還有部分公眾持“對此不關(guān)注不了解”態(tài)度。因此，在“河長制”宣傳工作上，還有很大的改進空間。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取的模板DNA濃度和質(zhì)量

2.2.1 反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果 （1）DNA模板濃度 根據(jù)預(yù)實驗設(shè)置了0.4、2.0、4.0、6.0、8.0ng/μL 5個DNA模板濃度梯度。模板DNA用量為10ng時，擴增條帶暗淡；之后，隨著模板DNA用量的增加（2.0～6.0ng/μL），條帶逐漸清晰、明亮，當(dāng)模板DNA用量4.0ng/μL時，擴增效果最佳；其大于6.0ng/μL時，條帶數(shù)目逐漸減少。這表明模板DNA用量過少時，擴增產(chǎn)物太少且條帶也暗淡（圖2）。模板DNA用量較大時，由于“平臺效應(yīng)”表現(xiàn)為條帶數(shù)量逐漸減少。據(jù)此實驗確定裸果木多態(tài)性研究的RAPD反應(yīng)合適的DNA模板濃度為4.0ng/μL（100ng）。

圖1 DNA電泳檢結(jié)果Fig.1 The DNA electrophoretic bands extracted from leaves

2.2 RAPD反應(yīng)體系優(yōu)化和程序確立

對提取的裸果木基因組DNA進行瓊脂糖凝膠電泳。DNA條帶明亮，無嚴重拖尾和降解現(xiàn)象，可見所提取的基因組DNA較完整，質(zhì)量較高，能應(yīng)用于RAPD反應(yīng)分析（圖1）。與λDNA的濃度梯度進行比較，估測出DNA的濃度為100ng/μL左右。經(jīng)紫外分光光度計檢測，D260mm/D280mm比值均在1.6～1.9。

（2）Mg2＋濃度 設(shè)置了1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L 5個 Mg2＋濃度梯度，設(shè)計的 Mg2＋濃度梯度均能擴增出條帶，但Mg2＋濃度2.0mmol/L時的擴增效果最好；當(dāng)Mg2＋濃度減少時，擴增條帶數(shù)目減少且亮度減弱；相反其用量增加時，擴增的條帶也表現(xiàn)出了相同的規(guī)律。這可能及Mg2＋及激活Taq酶的活性有關(guān)系，Mg2＋濃度過低時，Taq酶的活性難以完全被激活，導(dǎo)致擴增效率降低；而當(dāng)Mg2＋濃度過高時，Mg2＋會大量鰲合dNTP，從而降低了PCR擴增產(chǎn)物的量（圖3）。因此實驗確定裸果木多態(tài)性研究的RAPD反應(yīng)合適的Mg2＋濃度為2.0mmol/L。

（2）退火溫度 設(shè)定了32、34、36、38℃共4個溫度梯度。當(dāng)退火溫度較低時（32、34℃），擴增條帶數(shù)少且模糊；36℃時擴增的條帶最為清晰，分辨率最高；當(dāng)退火溫度高于36℃時，條帶數(shù)目減少的同時，分辨率也明顯下降（圖6）。因此實驗確定合適的退火溫度為36℃。

（3）dNTP濃度 實驗設(shè)置了0.1、0.5、0.9、1.2 mmol/L 4個dNTP濃度梯度。當(dāng)dNTP濃度小于0.5mmol/L時，擴增條帶數(shù)目少且亮度弱；在0.5 mmol/L時，擴增條帶清晰明亮，PCR反應(yīng)充分；而當(dāng)dNTP濃度為0.9、1.2mmol/L時，擴增條帶分辨率下降，出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，擴增的特異性下降（圖4）。因此實驗確定裸果木多態(tài)性研究的RAPD反應(yīng)合適的dNTP濃度為0.5mmol/L。

（4）引物濃度RAPD反應(yīng)中若引物濃度過高，會導(dǎo)致引物與模板之間的錯配，同時還會增大引物二聚體的形成幾率；而引物濃度過低會導(dǎo)致擴增不充分，甚至不能擴增。RAPD反應(yīng)中，設(shè)計了0.1、0.2、0.3、0.5μmol/L等4個引物濃度梯度，0.1～1.0μmol/L均可擴增出條帶，當(dāng)引物濃度低于0.5μmol/L時，擴增條帶數(shù)目少而暗弱，甚至有的位點觀測不到；當(dāng)引物濃度在0.5μmol/L時，擴增條帶清晰明亮，效果最佳，且重復(fù)性好；當(dāng)引物濃度較大時，由于非特異性擴增，導(dǎo)致分辨率嚴重下降，出現(xiàn)了彌散現(xiàn)象。因此實驗確定的裸果木多態(tài)性研究的RAPD反應(yīng)合適的引物濃度為0.3μmol/L。

2.2.2 RAPD方法擴增程序的優(yōu)化 （1）變性時間實驗依次設(shè)置了30、40、50s3個變性時間。隨著變性時間的延長，擴增條帶逐漸穩(wěn)定，在40s擴增出的條帶清晰（圖6）。

大數(shù)據(jù)背景下，企業(yè)會計信息不僅完善了數(shù)據(jù)共享功能，在各企業(yè)單位的具體交流上也密切起來，實現(xiàn)了企業(yè)及單位共享信息平臺建設(shè)，解決了財務(wù)信息“孤島”的問題。同時，大數(shù)據(jù)背景下的企業(yè)會計信息化建設(shè)能提高企業(yè)的重視程度，減少中小企業(yè)會計信息化實現(xiàn)程度參差不齊的問題，實現(xiàn)企業(yè)各部門、企業(yè)與企業(yè)間良好的信息共享和運行循環(huán)。

1.2.2 RAPD－PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化 PCR反應(yīng)在PE480型DNA擴增儀中進行。參考一般反應(yīng)體系［15］，分別在25μL反應(yīng)體系中加入模板 DNA、Mg2＋、dNTP、Taq酶、引物和ddH2O。之后蓋上蓋子振蕩混勻。設(shè)置94℃預(yù)變性5min，30個循環(huán)進行94℃變性45s，36℃退火40s，72℃延伸1min，72℃延伸10min。

優(yōu)化RAPD反應(yīng)體系時，固定擴增程序，每次改變RAPD反應(yīng)中的1個參數(shù)，以確定該參數(shù)對RAPD結(jié)果的影響。篩選的參數(shù)包括：（1）模板DNA質(zhì)量濃度；（2）dNTPs濃度；（3）引物用量；（4）Mg2＋濃度。同時對擴增程序中的退火溫度和變性時間也進行優(yōu)化，以找到合適的反應(yīng)條件。

圖8 優(yōu)化體系下12個樣品擴增的PCR結(jié)果（0～24）Fig.8 The PCR results of 12specimens with peimer 0～24 and optimized reaction system

最終確定的RAPD反應(yīng)為：在25μL反應(yīng)體系中，模板DNA用量為4.0ng/μL，引物濃度為0.3 μmol/L，dNTP濃度為0.5mmol/L，Mg2＋濃度為2.0 mmol/L，Taq酶用量為1U，ddH2O補足25μL；94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，36℃退火40s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；，最后72℃延伸10min，擴增結(jié)果穩(wěn)定。

3 討論

影響RAPD反應(yīng)的因素很多，任何一種因子設(shè)置不當(dāng)都會影響整個擴增反應(yīng)。RAPD反應(yīng)，對DNA純度要求不高，但模板DNA濃度是影響RAPD擴增產(chǎn)物產(chǎn)率與特異性的一個重要因子。模板過量，造成引物相對缺乏而抑制擴增反應(yīng)，使生成的條帶減少而出現(xiàn)不同的指紋圖。模板濃度過低，不能發(fā)生有效的擴增反應(yīng)或者擴增后圖譜變異較大［16］。在PCR反應(yīng)中，Mg2＋是TaqDNA聚合酶的激活劑，太低或太高都將影響酶的活性，其濃度還影響引物與模扳的解鏈與退火。一般需將 Mg2＋濃度控制在大于2μmol/L，低于此濃度會導(dǎo)致擴增條帶的穩(wěn)定性及可靠性。引物在RAPD反應(yīng)中是一關(guān)鍵因素。但RAPD擴增反應(yīng)對引物也沒有嚴格的種屬界限，引物的設(shè)計除長度較短，為10個堿基左右外，其余規(guī)則與一般PCR相同。

dNTPs是PCR反應(yīng)的底物，其濃度高低會影響到擴增產(chǎn)物的多少。濃度過低，在反應(yīng)過程中dNTPs被過早消耗完后，會減少擴增產(chǎn)物的產(chǎn)量［17］；dNTPs濃度過高時，則會與TaqDNA聚合酶爭奪 Mg2＋，使Taq酶活性降低，不能充分發(fā)揮聚合作用而導(dǎo)致擴增失敗。

此外，變性時間是影響RAPD反應(yīng)最重要的因子之一。如變性時間過短，DNA模板將不能充分解鏈，引物就不能完全結(jié)合到DNA模板上，從而導(dǎo)致擴增條帶較少；如變性時間過長，會影響Taq酶活力，降低擴增效率，導(dǎo)致擴增結(jié)果的不穩(wěn)定和效率低等問題［18］。故應(yīng)參考相關(guān)反應(yīng)體系，在保證條帶清晰、穩(wěn)定的條件下，選擇合適的變性時間，保證Taq酶的活性，達到擴增的最佳效果。退火溫度對PCR反應(yīng)的特異性具有非常重要的作用。在RAPD反應(yīng)中，引物只有10bp，40℃以上的退火溫度會影響引物與模板的結(jié)合穩(wěn)定性，所以一般都低于40℃。

開頭十二個小節(jié)的連線都沒有超過一個小節(jié)的長度，但是從第13至16小節(jié)，卻用了長達四小節(jié)的連線，并且還有“漸強”的標(biāo)記。貝多芬在這里暗示了一種更為歌唱性的句法。

研究對影響裸果木RAPD擴增體系的一些因子進行了實驗和分析，建立了一個比較穩(wěn)定的RAPD擴增體系。但是要獲得重復(fù)性較好的結(jié)果，除了采用建立起來的最佳體系外，還應(yīng)將多個裸果木群體同時分析，將特異的標(biāo)記轉(zhuǎn)化成SCAR來進一步提高其穩(wěn)定性，以用于橫向比較，為資源的保護與利用提供依據(jù)。由于對裸果木基因組DNA進行RAPD分析的報道極少，為了尋找適合此次實驗的最佳RAPD反應(yīng)體系，采用單因子梯度設(shè)計分別對反應(yīng)體系中的模板DNA濃度、引物濃度、Mg2＋濃度、dNTPs濃度、變形時間及退火溫度進行了梯度實驗和反應(yīng)條件的優(yōu)化。通過優(yōu)化，獲得了穩(wěn)定性較好，重復(fù)性比較高的擴增產(chǎn)物，建立了一套適合裸果木的RAPD反應(yīng)體系，為進一步對裸果木基因組進行RAPD多態(tài)性分析，展開裸果木的遺傳多樣性研究和種質(zhì)資源保護提供了有價值的科學(xué)參考。

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