李顯剛，姚 拓，王小利，舒健虹，陸瑞霞

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州730070；2.貴州省草業(yè)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006）

近年來(lái)，如何有效解決我國(guó)土壤普遍缺磷，提高土壤磷的循環(huán)利用效率成為磷研究方面的熱點(diǎn)。利用微生物提高土壤中難溶性磷的生物有效性，對(duì)于促進(jìn)作物增產(chǎn)和環(huán)境保護(hù)具有重要意義［1－4］，其中植物根際磷細(xì)菌與土壤中無(wú)機(jī)磷的轉(zhuǎn)化、貯藏及供應(yīng)關(guān)系密切，在改善土壤供磷性能和結(jié)構(gòu)方面作用顯著［5］。因此，新型溶磷微生物肥料的開發(fā)利用潛力巨大。

葛藤（Pueraria lobata）為多年生草質(zhì)藤本植物，適應(yīng)性強(qiáng)、耐寒、抗旱，其根、莖、葉、花等都含有豐富的營(yíng)養(yǎng)，根瘤發(fā)達(dá)，固氮多，是發(fā)展現(xiàn)代農(nóng)牧業(yè)的理想植物。葛藤的莖、枝、葉含有粗蛋白質(zhì)20.89%～29.20%、粗脂肪2.45%～4.20%、粗纖維26.55%～34.189%、灰分5.91%～9.97%、鈣2.11%、磷0.09%和無(wú)氮浸出物30.39%～40.70%；同時(shí)莖、枝、葉中干物質(zhì)含量為鮮草重量的22.30%，其中總能量17.53～18.62MJ/kg、消化能11.51MJ/kg、可消化粗蛋白質(zhì)209g/kg［6］。目前，葛藤的藥用、飼用及生態(tài)等方面的開發(fā)利用價(jià)值正在提升，獲得了巨大的經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益和生態(tài)效益［7］。近年來(lái)，溶磷細(xì)菌的研究多集中在部分牧草、農(nóng)作物及土壤中［8－10］，對(duì)于藤本類飼料植物研究報(bào)道較少。此次對(duì)生長(zhǎng)于貴州黃壤地區(qū)的葛藤根際溶磷菌進(jìn)行分離，并根據(jù)不同菌株的溶磷強(qiáng)度、分泌IAA能力、產(chǎn)酸產(chǎn)堿性能及碳源利用特性篩選優(yōu)良菌種，為開發(fā)利用葛藤根際溶磷微生物資源，提高喀斯特地區(qū)黃壤中磷素的循環(huán)利用率提供基礎(chǔ)材料，同時(shí)為葛藤的綠色無(wú)公害生產(chǎn)提供磷素營(yíng)養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

以5點(diǎn)法采集生長(zhǎng)于貴州南部黃壤中（貴州省草業(yè)研究所試驗(yàn)地）的葛藤根系及根際土壤樣品5份，每份樣品重0.5～1.0kg，采樣時(shí)間為2010年10月；采樣地土壤pH 5.97，有機(jī)質(zhì)1.695%，全氮0.218%，水解氮156.98mg/kg，有效磷15.02mg/kg，速效鉀為10.20mg/kg。

1.2 溶磷細(xì)菌篩選

1.2.1 培養(yǎng)基 分離溶磷菌培養(yǎng)基（PKO）［11］：葡萄糖10.0g、NaCl 0.2g、（NH4）2SO40.5g、MgSO4·7H2O 0.1g、KCl 0.2g、MnSO40.03g、FeSO4·7H2O 0.003g、酵母粉0.5g、瓊脂15.0～20.0g、加蒸餾水至1 000mL、pH 6.8～7.2，含磷酸鈣3.0g，有改進(jìn)。保存用LB培養(yǎng)基。

1.2.2 溶磷圈法篩選溶磷細(xì)菌 按常規(guī)分離細(xì)菌法［12］涂布樣品懸液于含難溶性磷酸鈣的PKO無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基平板上，28℃倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至有類似溶磷菌的分離物后，挑取分離物進(jìn)行純化，再點(diǎn)接種于含難溶性磷酸鈣的PKO固體培養(yǎng)基上進(jìn)行溶磷菌株篩選［13］。

1.3 溶磷強(qiáng)度測(cè)定

采用鉬銻抗比色法測(cè)定有效磷含量。接種0.5 mL活化菌株菌懸液裝入50mL滅菌的無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基，28℃、150r/min恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)7d。然后取培養(yǎng)液在10 000r/min轉(zhuǎn)速下離心10min，取適量上清液測(cè)磷含量，菌株溶磷量為培養(yǎng)液磷含量減去對(duì)照磷含量（以P mg/L表示），酸度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液pH值。每菌株重復(fù)3次，對(duì)照不接菌。

1.4 溶磷細(xì)菌分泌IAA能力測(cè)定

接種0.5mL菌懸液于裝有滅菌30mL King液體培養(yǎng)基，同1.3條件震蕩培養(yǎng)離心后，取菌株懸浮液1mL滴置于檢測(cè)板上，加入等量S2比色液，同時(shí)在比色液中分別加50μg/mL、30μg/mL、10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)植物生長(zhǎng)激素（IAA）1mL作梯度對(duì)照，15min內(nèi)室溫下觀察其顏色變化，確定菌株是否分泌IAA［14］。分泌IAA的菌株取上清液1mL加S2比色液1mL在黑暗中靜置30min后，用紫外分光光度計(jì)（530nm）測(cè)定吸光度，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算菌株分泌IAA量（單位：mg/L）。S2比色液：氯化鐵4.5g，10.8moL/L濃硫酸1 000mL。

1.5 菌株產(chǎn)酸產(chǎn)堿性能測(cè)定

接種分離到的菌株純培養(yǎng)物于盛有已滅菌30mL NFM液體培養(yǎng)基的三角瓶中，每一菌株3個(gè)重復(fù)。三角瓶置于28℃恒溫?fù)u床上，于125r/min培養(yǎng)72h，觀察并記錄培養(yǎng)基顏色變化。菌懸液顏色不變色（草綠色或綠色）則為中性菌株；變成黃色，表明其為產(chǎn)酸菌株；變成藍(lán)色為產(chǎn)堿菌株。同時(shí)，利用pH酸度計(jì)測(cè)定菌株懸浮液的pH值，以驗(yàn)證菌株懸液的酸堿性。

1.6 菌株碳源利用特性測(cè)定

在LB培養(yǎng)基中分別以甘露醇、蔗糖、1/2甘露醇＋1/2蔗糖、木糖、麥芽糖、葡萄糖取代蛋白胨，制成不同碳源培養(yǎng)基。用接種環(huán)挑取適量菌株純培養(yǎng)物，以平板劃線法將其分別接種于不同碳源培養(yǎng)基上，置于28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。觀察并記錄菌株菌落生長(zhǎng)情況。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶磷菌株及其菌落特征

經(jīng)溶磷圈法篩選，從葛藤根際土壤樣品共篩選出8株溶解磷酸鈣較強(qiáng)的溶磷細(xì)菌。HD（溶磷圈直徑）/CD（菌落直徑）值及菌落特征見表1。菌株在LB培養(yǎng)基上的菌落特征多乳白色、不透明、半濕潤(rùn)扁平，均不產(chǎn)生色素。8株溶磷細(xì)菌在含難溶磷酸鈣的無(wú)機(jī)磷平板上生長(zhǎng)10d時(shí) HD/CD值均在2.0以上，其中GTR2產(chǎn)生的溶磷圈最大，菌落最小，HD/CD比值高達(dá)6.73，說(shuō)明GTR2可能具有較強(qiáng)溶磷能力。但多數(shù)菌株HD/CD比值在2.1～2.5。培養(yǎng)過(guò)程觀察發(fā)現(xiàn)，多數(shù)菌株菌落在1～2d清晰可見，菌株在培養(yǎng)前2d時(shí)，透明圈增長(zhǎng)快，但不會(huì)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而變大。

2.2 不同菌株溶磷強(qiáng)度

一般地，準(zhǔn)確描述溶磷菌溶磷效果的方法是將菌株接種于液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)7～10d測(cè)定培養(yǎng)液可溶性磷含量［15］。供試菌株經(jīng)7d的振蕩培養(yǎng)后，葛藤根際溶磷菌溶解難溶性磷酸鈣的能力有所差異（表2），有效磷含量72.28～159.15mg/L，GTR12、GTR15及GTR2與其余菌株間有效磷含量差異達(dá)極顯著（P＜0.01）。其中GTR2菌株有效磷含量高達(dá)159.15mg/L，溶解磷酸鈣能力最強(qiáng)；GTR12、GTR15及GTR4次之。GTR5溶解磷酸鈣能力最差，有效磷含量?jī)H為72.28mg/L。不同菌株溶磷能力為GTR2＞GTR12＞GTR15＞GTR4＞GTR11＞GTR6＞GTR3＞GTR5。研究發(fā)現(xiàn)，菌株培養(yǎng)液pH值與對(duì)照pH值7.0相比均有所下降，其中pH值最低的為3.06（GTR2），最高的為5.46（GTR3和GTR6）。

2.3 不同菌株分泌IAA能力

8株葛藤根際溶磷菌分泌IAA能力定性的顯色反應(yīng)結(jié)果表明（表2），多數(shù)溶磷菌在具有溶解難溶性磷的同時(shí)還具有分泌生長(zhǎng)素的功能。其中僅有GTR12無(wú)顏色反應(yīng)，不分泌IAA；GTR15、GTR2、GTR3菌株的顯色反應(yīng)為粉紅色，可能具有較強(qiáng)的分泌IAA的能力；菌株GTR5、GTR6、GTR4及GTR11顯色反應(yīng)呈淺粉紅色，分泌IAA能力可能較弱。溶磷菌分泌IAA能力的定量測(cè)定與定性測(cè)定結(jié)果具有相對(duì)一致性，即GTR15和GTR2顯粉紅色，分泌IAA量分別為14.44 mg/L和12.71mg/L，均顯著高于其余菌株（P＜0.01）。GTR11分泌IAA量最小，為1.25mg/L。

表1 不同菌株HD/CD值及菌落特征Table 1 Colonial characteristics and HD/CD value of different phosphate solubilizing bacteria

表2 不同菌株溶解無(wú)機(jī)磷及分泌IAA能力Table 2 The ability of different strains for inorganic phosphorus solubilizing and IAA producing

2.4 不同菌株產(chǎn)酸產(chǎn)堿性能

8株溶磷菌株中6株為產(chǎn)堿菌株，占供試菌株的75.00%，菌株培養(yǎng)液顏色為藍(lán)色，pH 值在7.12～7.97。有2株為中性菌株，即GTR3和GTR12，pH值分別為7.02和7.05，菌株培養(yǎng)液顏色為原培養(yǎng)基顏色（綠色）。供試菌株中沒(méi)有產(chǎn)酸菌株（表3）。

表3 不同菌株產(chǎn)酸產(chǎn)堿性能Table 3 Acid or alkaline producer of different strains

2.5 不同菌株碳源利用特性

供試菌株幾乎都能在以甘露醇、蔗糖、1/2甘露醇＋1/2蔗糖、葡萄糖、木糖、麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上良好生長(zhǎng)（表4）。其中除GTR5、GTR2、GTR11分別在含甘露醇、蔗糖及1/2甘露醇＋1/2蔗糖、麥芽糖碳源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較好外，在其余供試碳源培養(yǎng)基上都能茂盛生長(zhǎng)，這可能與各菌株本身特性、對(duì)不同碳源利用的差異性及碳源自身性狀有關(guān)。

表4 不同菌株碳源利用情況Table 4 Features of different strains for utilizing different carbon sources

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

葛藤獨(dú)特的生態(tài)、飼用及藥用價(jià)值，越來(lái)越受到研究者及投資者的關(guān)注。據(jù)報(bào)道，土壤中能夠溶解難溶磷酸鹽的微生物比例較高，極端情況下高達(dá)70%～80%［16］。從貴州黃壤地區(qū)葛藤根系及根際土壤中分離獲得8株具有較強(qiáng)溶解磷酸鈣能力的溶磷細(xì)菌，表明葛藤根際中存在大量利用潛力大，且可能具促生、非致病性的溶磷類微生物。供試溶磷菌的HD/CD值在2.14～6.73，多數(shù)菌株 HD/CD值高于林啟美等［17］測(cè)得假單胞菌屬培養(yǎng)7d時(shí)的 HD/CD值（1.00～3.50），這可能與菌株本身溶磷特點(diǎn)有關(guān)［18］。液體振蕩培養(yǎng)下溶解磷酸鈣的量為72.28～159.15mg/L，與陶濤等［19］從水稻根際分離測(cè)得幾株溶磷菌的溶磷量102.77～174.08mg/L相當(dāng)，低于李鵬等［20］從珠芽蓼分離的溶磷內(nèi)生細(xì)菌溶磷量（902.14mg/L），說(shuō)明不同植物根系及根際土壤中的溶磷細(xì)菌對(duì)磷酸鈣的溶解能力大小各異。此外，有研究表明，不同菌株溶解磷酸鈣能力差異較大［21］的原因可能與菌株種類、根際環(huán)境及溶磷機(jī)理不同有關(guān)，同時(shí)，植物根際溶磷菌的溶磷量還可能受土壤物理結(jié)構(gòu)、土壤類型及土壤肥力、土壤耕作方式、前茬植物和有機(jī)質(zhì)含量不同等因素影響［22，23］。如各菌株懸液pH值均較對(duì)照下降，一方面可能是培養(yǎng)液中Ca－P的存在對(duì)pH值變化的緩沖作用逐漸消失所致，另一方面可能是菌株分泌某些酸性物質(zhì)，致使培養(yǎng)液pH值下降，難溶性磷酸鈣溶解。諸如溶磷菌的其他溶磷機(jī)理，如菌株在發(fā)酵過(guò)程中是否產(chǎn)生磷酸酶與溶磷能力大小有關(guān)等因素目前尚在試驗(yàn)中。

許多研究表明，存在于植物根際的微生物同時(shí)具有多種功能［24］。如眾多禾本科及豆科牧草根際聯(lián)合固氮菌、根瘤菌和溶磷菌具有分泌IAA的能力，分泌的IAA容易在植物根毛區(qū)被吸收利用，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)［25］，韓文星等［26］在研究溶磷接種劑對(duì)燕麥生長(zhǎng)和品質(zhì)的試驗(yàn)中，得到在含有溶磷菌（同時(shí)能分泌IAA）的各處理，燕麥株高、生物量、根長(zhǎng)及粗蛋白含量等均顯著高于對(duì)照。此試驗(yàn)中僅菌株GTR12未分泌IAA，其余溶磷細(xì)菌均具分泌IAA能力，如將這些菌株作為接種劑施用，可能會(huì)提高葛藤發(fā)達(dá)的根瘤菌固氮性能及根際磷素的利用率。此外，已有報(bào)道稱，水稻植株中的內(nèi)生成團(tuán)腸桿菌YS19能分泌生長(zhǎng)素、細(xì)胞脫落酸、赤霉素和細(xì)胞分裂素，其中細(xì)胞分裂素有3種，即異戊烯腺嘌呤、玉米素核苷和二氫玉米素核苷［27］，鑒于此，作物根際細(xì)菌中包括IAA等多種激素產(chǎn)生的普遍性，有利于細(xì)菌第2代產(chǎn)物（如鐵載體）產(chǎn)生、分子氮的固定、對(duì)土傳病原物的拮抗和難溶磷酸鹽的溶解等，這些對(duì)確定根際微生物擁有一個(gè)或更多的PGPR特性至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)將在后期對(duì)菌株產(chǎn)生IAA的途徑及是否分泌赤霉素等其他激素類物質(zhì)、對(duì)植物的促生效應(yīng)作深入探討與研究。

3.2 結(jié)論

菌株GTR2和GTR15具有較高溶磷和分泌IAA能力，同時(shí)碳源利用范圍廣，有望作為高效溶磷接種劑的菌種資源。

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