白生軍，馬暉玲，馬 祥，安惠惠

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

草地早熟禾（Poa pratensis）是禾本科早熟禾屬一種優(yōu)質(zhì)冷季型草坪草。草地早熟禾抗寒性較差［1］，植物生殖方式復(fù)雜多樣，常以兼性無融合生殖方式進(jìn)行繁殖［2－6］，有些品種無融合生殖率高達(dá)98%以上［3，6］，有性雜交率低，很難獲得雜種優(yōu)勢品種。以原生質(zhì)體培養(yǎng)為基礎(chǔ)和前提條件的體細(xì)胞雜交技術(shù)不失為選育草地早熟禾雜種細(xì)胞可行而有效的育種途徑之一。Vander等［7］開創(chuàng)了草地早熟禾原生質(zhì)體培養(yǎng)的先河，Kisten等［8］的研究進(jìn)一步奠定草地早熟禾原生質(zhì)體培養(yǎng)的基礎(chǔ)，但目前來看，早熟禾體細(xì)胞雜交技術(shù)還不成熟，研究相對不夠深入，僅獲得一些階段性成果［9，10］。

實驗以草地早熟禾午夜2號（MidnightⅡ）、新格萊德（Nuglade）和橄欖球2號（RugbyⅡ）3個品種的優(yōu)質(zhì)愈傷組織為材料，研究不同培養(yǎng)方式和pH對原生質(zhì)體分裂和生長的影響，探索不同品種原生質(zhì)體的最佳培養(yǎng)方式，以期為進(jìn)一步完善草地早熟禾的原生質(zhì)體培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

將3個草地早熟禾午夜2號、新格萊德和橄欖球2號品種的成熟種子接種于添加各品種誘導(dǎo)愈傷組織適宜濃度激素的 MS培養(yǎng)基上（午夜2號：1mg/L 2，4－D＋0.3mg/L 6－BA；新格萊德：3mg/L 2，4－D＋0.5 mg/L 6－BA；橄欖球2號：3mg/L 2，4－D＋0.1mg/L 6－BA；），誘導(dǎo)并優(yōu)化培養(yǎng)得到生長狀態(tài)質(zhì)地良好的愈傷組織。

1.2 實驗方法

挑選各品種繼代20次生長狀態(tài)良好的愈傷組織1g，置10mL酶液（13%甘露醇CPW＋1%的纖維素酶＋1%的離析酶＋0.3%的崩潰酶＋0.3%的果膠酶和5mol/L的 MES，pH 5.8），25±1℃，50r/min搖床暗中酶解16h。用200目和300目尼龍網(wǎng)過濾混合液，離心5min，依次用CPW－13溶液和原生質(zhì)體培養(yǎng)液清洗2～3次后用培養(yǎng)液調(diào)整原生質(zhì)體密度為2×105個/mL后進(jìn)行培養(yǎng)［11］。

用液體淺層培養(yǎng)和固液雙層培養(yǎng)進(jìn)行草地早熟禾原生質(zhì)體培養(yǎng)。其中，液體淺層培養(yǎng)以KM8P為基本培養(yǎng)基，添加不同品種各自愈傷組織誘導(dǎo)時適宜濃度的激素（0.45μm微孔濾膜抽濾滅菌），將純化得到的原生質(zhì)體懸浮于其中，滴加2mL懸浮液到直徑6cm的培養(yǎng)皿底部，形成一薄層，用保鮮膜封口，于26±1℃下，恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；固液雙層培養(yǎng)法：在培養(yǎng)皿底部先鋪8～10mL MS培養(yǎng)基（不添加激素，pH 5.8），再在上面滴加2mL含有原生質(zhì)體的KM8P培養(yǎng)液進(jìn)行淺層培養(yǎng)，用保鮮膜封口，于26±1℃下恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每天輕輕晃動培養(yǎng)皿數(shù)次，使原生質(zhì)體與氧氣充分接觸。KM8P培養(yǎng)液的pH值設(shè)置5.6、5.8、6.0共3個水平。

原生質(zhì)體培養(yǎng)15d后在倒置顯微鏡下統(tǒng)計分裂頻率。比較不同品種的草地早熟禾原生質(zhì)體的分裂生長及再生能力差異。

原生質(zhì)體分裂頻率（%）＝（分裂的原生質(zhì)體數(shù)/接種原生質(zhì)體數(shù)）×100

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)方式及培養(yǎng)基pH對3個品種原生質(zhì)體分裂的影響

培養(yǎng)方式和培養(yǎng)基的pH對午夜2號原生質(zhì)體的分裂生長均有影響。固液雙層培養(yǎng)比液體淺層培養(yǎng)更能得到較高的原生質(zhì)體分裂率（圖1）。

圖1 不同培養(yǎng)方式和培養(yǎng)基pH對午夜2號原生質(zhì)體分裂生長的影響Fig.1 Effect of different cultivation methods and pH of medium on growth of MidnightⅡprotoplast

pH對原生質(zhì)體的分裂率具有明顯影響。固液雙層培養(yǎng)中，pH5.8時原生質(zhì)體分裂率最大（42.8%），顯著高于pH為5.6和6.0時的分裂率。研究表明，午夜2號原生質(zhì)體培養(yǎng)過程中，最適宜的培養(yǎng)條件是固液雙層培養(yǎng)方式，pH為5.8。

新格萊德的培養(yǎng)基pH為5.6時，原生質(zhì)體分裂率在2種培養(yǎng)方式中均最低，而pH為5.8和6.0時，2種培養(yǎng)方式中原生質(zhì)體分裂率相近，均在45%，固液雙層培養(yǎng)，pH6.0時原生質(zhì)體分裂率達(dá)到最大值，為50.1%（圖2）。

圖2 不同培養(yǎng)方式和培養(yǎng)基pH對新格萊德原生質(zhì)體分裂生長的影響Fig.2 Effect of different cultivation methods and pH of medium on growth of Nuglade protoplast

培養(yǎng)方式和pH對橄欖球2號原生質(zhì)體分裂的影響不甚明顯，原生質(zhì)體分裂率均保持在22.5%～29.4%。同一pH值下，相對液體淺層培養(yǎng)，橄欖球2號原生質(zhì)體培養(yǎng)采用固液雙層培養(yǎng)可得到較高的原生質(zhì)體分裂率；下層固體培養(yǎng)基和上層液體培養(yǎng)基pH均為5.8時，原生質(zhì)體分裂率達(dá)到最大值，為29.4%（圖3）。

圖3 不同培養(yǎng)方式和培養(yǎng)基pH對橄欖球2號原生質(zhì)體分裂生長的影響Fig.3 Effect of different cultivation methods and pH of medium on growth of RugbyⅡprotoplast

2.2 3個草地早熟禾品種原生質(zhì)體形態(tài)及其變化

原生質(zhì)體培養(yǎng)初期，3個草地早熟禾品種的原生質(zhì)體狀態(tài)基本相似，在倒置顯微鏡下觀察均表現(xiàn)為形狀規(guī)則、邊緣清晰、大小均一和內(nèi)含物較多的特性（圖4A）。培養(yǎng)2～3d后，可觀察到原生質(zhì)體再生細(xì)胞的第1次、第2次分裂（圖4B，C）。隨后再生細(xì)胞持續(xù)分裂，在低倍鏡下即可觀察到再生細(xì)胞形成的小細(xì)胞團(tuán)（圖4D）。比較3個品種原生質(zhì)體分裂率發(fā)現(xiàn)，新格萊德原生質(zhì)體的分裂率最高（圖2），午夜2號略低于新格萊德（圖1），而橄欖球2號原生質(zhì)體的分裂率遠(yuǎn)低于前兩者（圖3）。

圖4 A優(yōu)質(zhì)的原生質(zhì)體；B原生質(zhì)體再生細(xì)胞第一次分裂；C原生質(zhì)體再生細(xì)胞第二次分裂；D原生質(zhì)體分裂產(chǎn)生的小細(xì)胞團(tuán)Fig.4 A Superior protoplasts；B The first division of protoplast－derived cell；C The second division of protoplast－derived cell；D The Cell clusters formed from protoplasts

3 討論

3.1 不同培養(yǎng)方式對原生質(zhì)體分裂和生長的影響

不同的培養(yǎng)方式為原生質(zhì)體提供不同的生長環(huán)境，液體淺層培養(yǎng)適用于較易分裂的原生質(zhì)體，操作比較簡單，對原生質(zhì)體損傷較小，能有效防止有害物質(zhì)過多積累，且易于添加新鮮培養(yǎng)基。但該方法也存在諸如原生質(zhì)體分布不均勻、原生質(zhì)體粘連、難以定點觀察原生質(zhì)體等缺點。固液雙層培養(yǎng)是對液體淺層培養(yǎng)的改善。培養(yǎng)過程中，固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分可以被上層液體中的原生質(zhì)體吸收利用，同時，原生質(zhì)體產(chǎn)生的有害代謝物可被固體培養(yǎng)基吸收，尤其在固體培養(yǎng)基中添加吸附劑時這種吸附作用更明顯。黃文川等［12］研究了液體淺層培養(yǎng)和固液雙層培養(yǎng)對煙草原生質(zhì)體分裂率的影響，發(fā)現(xiàn)固液雙層培養(yǎng)的原生質(zhì)體分裂率顯著高于液體淺層培養(yǎng)時的分裂率，當(dāng)加厚雙層培養(yǎng)基中的固相至液相厚度的4～5倍時，更有利于煙草愈傷組織的快速形成和植株再生。實驗以2種培養(yǎng)方式對3個草地早熟禾品種的原生質(zhì)體進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果表明，固液雙層培養(yǎng)比液體淺層培養(yǎng)效果好，在固液雙層培養(yǎng)中原生質(zhì)體具有較高的分裂頻率。

3.2 培養(yǎng)基pH對原生質(zhì)體分裂和生長的影響

原生質(zhì)體在液體培養(yǎng)過程中，被完全浸沒在培養(yǎng)液中，液體培養(yǎng)基的pH值通過影響滲透壓穩(wěn)定劑活性而影響原生質(zhì)體的分裂、生長，酶液的pH值條件主要影響溶壁酶系統(tǒng)和滲透壓穩(wěn)定劑活性［14］。當(dāng)培養(yǎng)基pH低于6.0時，新格萊德原生質(zhì)體分裂率下降，午夜2號和橄欖球2號原生質(zhì)體在培養(yǎng)基pH為5.8時也達(dá)到最大分裂頻率。這與馬向東等［13］的研究結(jié)果一致，但金凌云研究［15］認(rèn)為，原生質(zhì)體再生率與pH關(guān)系不大，今后有待進(jìn)一步研究。

3.3 基因型的差異與原生質(zhì)體生長和分裂的影響

實驗研究中，選取20次繼代后第8d生長狀態(tài)相近的愈傷組織進(jìn)行原生質(zhì)體游離和培養(yǎng)，培養(yǎng)條件和培養(yǎng)密度相同，但3個品種原生質(zhì)體分裂率呈現(xiàn)出較大差異。培養(yǎng)初期未見品種間差異，持續(xù)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)橄欖球Ⅱ號再生細(xì)胞在培養(yǎng)過程中停止分裂生長，而新格萊德和午夜Ⅱ號再生細(xì)胞能持續(xù)分裂，長勢良好。可見不同品種之間原生質(zhì)體培養(yǎng)效果差異很大，趙小強(qiáng)［11］對于草地早熟禾原生質(zhì)體培養(yǎng)的研究結(jié)果也證實了這一結(jié)論，可能是由于原生質(zhì)體供體材料的生理狀態(tài)的差異造成的［16］。故合適的基因型是進(jìn)行草地早熟禾原生質(zhì)體培養(yǎng)成功的重要條件［5］。

［1］ 李顯利，米福貴，閆立軍，等.草地早熟禾不同品種抗旱性的評價分析［J］.草原與草坪，2010，30（3）：43－46.

［2］ Akerberg E.Apomictic and sexual seed formation in poa pratensis L［J］.Hereditas，1979，25：359－371.

［3］ Bashaw E C.Apomixis and its application in crop improvement［M］//W R Fehr，H H Hadley，Hybridization of crop plants.New York：Amer.Madison Press，1980：455－633.

［4］ Grazi F M.Observation on the mode of reproduction and embryology of poa pratensis L［J］.Hereditas，1961，47：489－541.

［5］ Hanna W W，E C Bashaw.Apomixis：its identification and use in planting breeding［J］.Crop Science，1987，27（6）：1136－1139.

［6］ 殷朝珍，王兆龍，葛才林.草地早熟禾無融合生殖及其育種利用研究進(jìn)展［J］.草原與草坪，2006（1）：18－23.

［7］ Vander V，Zaal P，Creemers－Molenaar J.Regeneration of albino plantlets from suspension culture derived proto－plasts of Kentucky bluegrass（Poa protensis L）［J］.Euphytica，1988（5）：169－176.

［8］ Kirsten Annette Nielsen，Else Larsen，Elisabeth Knudsen.Regeneration of protoplast－derived green plants of Kentucky Bluegrass（Poa pratensis L）［J］.Plant Cell Report，1993（12）：537－540.

［9］ 馬暉玲，趙小強(qiáng)，白小明.草地早熟禾午夜Ⅱ號原生質(zhì)體培養(yǎng)及植株再生［J］.草地學(xué)報，2010，18（1）：103－107.

［10］ 趙小強(qiáng)，馬暉玲，林棟，等.草地早熟禾新格萊德胚性愈傷組織原生質(zhì)體培養(yǎng)及植株再生的研究［J］.草業(yè)學(xué)報，2010，19（2）：55－66.

［11］ 趙小強(qiáng).草地早熟禾原生質(zhì)體培養(yǎng)及體細(xì)胞的雜交［D］.甘肅：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

［12］ 黃文川，楊其光.一種簡化有效的普通煙草原生質(zhì)體培養(yǎng)方法［J］.西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2000，28（6）：101－103.

［13］ 朱至清.植物細(xì)胞工程［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003：25.

［14］ 馬向東.猴頭菌原生質(zhì)體制備條件的研究［J］.河南科學(xué)，1995，13（1）：65－69.

［15］ 金凌云.蛹蟲草原生質(zhì)體誘變及主要活性物質(zhì)提取工藝研究［D］.陜西：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2010.

［16］ 馬暉玲，張崇浩，肖尊安，等.影響植物原生質(zhì)體分裂的生理生化因素［J］.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1998，33（1）：42－46.