常蕓 楊紅霞 彭澤胄

國家體育總局體育科學研究所（北京 100061）

運動性心律失常越來越引起運動醫(yī)學領域關注，相當一部分運動性心律失常影響到運動員的身體健康、系統(tǒng)訓練以及比賽成績［1-2］。近年，國內外研究報道運動員心律失常發(fā)生率高于正常人，且專項訓練年限長的運動員中更常見，運動員退賽退役屢見不鮮［3］。而運動性心律失常的發(fā)生機制又極其復雜，涉及眾多因素。盡管運動醫(yī)學界對此進行了廣泛的臨床觀察與調研，迄今，運動性心律失常的發(fā)生機制仍未完全闡明。心臟傳導系統(tǒng)作為心電活動的控制中心和沖動傳導的重要部位，其特殊的組織結構和細胞類型決定其具有不同于普通心肌的心電起搏和傳導功能，與各種類型心律失常的發(fā)生和發(fā)展具有密切關系［4］。

心臟終生不停的搏動依賴于心臟強大的能量代謝系統(tǒng)的結構與功能，通常正常心肌能量的70%來源于脂肪酸氧化，因此，線粒體脂肪酸β氧化對維持心肌能量代謝和泵功能有重要意義。過氧化體增殖物激活型受體α（PPARα）作為心肌脂質和能量代謝的重要調控轉錄因子，調控著出生后心肌線粒體編碼脂肪酸β氧化酶類的基因表達，對維持心肌能量代謝和泵功能有重要作用，而運動對心臟傳導系統(tǒng)PPARα的影響鮮有報道。為此，本研究進行了力竭運動對心臟傳導系統(tǒng)代謝調控PPARα表達的研究，為闡明運動性心律失常的病理改變與發(fā)生機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

健康雄性成年SD大鼠100只，8周齡，體重（220±8）g。國家標準嚙齒動物飼料喂養(yǎng)，自由飲食。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫（20±2）℃，光照時間 12小時，相對濕度40%～55%。

1.2 運動負荷

將100只實驗大鼠隨機分為10組，每組10只。其中一次力竭和2周反復力竭游泳運動各4組：運動后即刻組、4小時組、12小時組和24小時組，相應的安靜對照組2組。安靜對照組不運動，力竭運動各組大鼠尾部負重為體重的3%，2周反復運動組每周運動6天，每天1次。力竭標準參照Thomas的報道［5］。

1.3 心電圖描記

所有大鼠于最后一次游泳訓練前稱重。力竭運動離開水面后，迅速用熱吹風機和干布將其皮毛擦干，仰臥固定，采用ADInstruments LabChart 7記錄并分析大鼠綜合導聯(lián)心電圖。具體計算指標與方法見先前報道［4］。

1.4 取材

分別于最后一次力竭運動后即刻、4小時、12小時及24小時等不同時相取材，迅速取出心臟，用OCT包埋，液氮驟冷，作全心連續(xù)冰凍切片，光鏡定位心臟傳導系統(tǒng)，運用激光顯微切割儀切割，分別收集竇房結細胞或細胞團。

1.5 實時熒光定量PCR檢測

采用Trizol法提取總RNA，并逆轉錄cDNA，存于-20℃?zhèn)溆?。通過互聯(lián)網(wǎng)搜索Genbank查找目標因子結蛋白和內參照β-actin的引物基因序列，應用Primer 5軟件進行引物設計（表1），設計的引物由上海生工生物技術有限公司合成。引物擴增目標基因片斷長度均小于150 bp，其PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證引物可用后，再進行實時熒光定量PCR，其中預變性 95℃ 30 s，PCR 反應 95℃ 10 s，60℃30 s，40個循環(huán)。檢測CT值。利用SDS2.2軟件對實時定量PCR數(shù)據(jù)進行分析處理，并導出文件及圖像。利用管家基因對目的基因的表達進行校正，得到相對定量結果（相對數(shù)值）。

1.6 免疫熒光檢測

采用免疫熒光組織化學方法染色心臟傳導系統(tǒng)冰凍切片，采用Leica AD MDW活細胞多維圖成像工作站和Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)對目標因子蛋白熒光強度進行定量，熒光強度用積分灰度表示（IOD），參考陰性對照標本中的熒光強度，灰度值在40～130之間為蛋白陽性表達。

表1 PCR引物序列

1.7 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行處理，結果用平均數(shù)±標準差表示，組間比較采用多因素方差分析，顯著性水平為P<0.05。

2 結果

2.1 心臟傳導系統(tǒng)形態(tài)觀察和心電圖變化

兩種力竭運動后，均有部分大鼠出現(xiàn)心律失常，心臟肉眼觀察有不同程度的充血，且反復力竭游泳運動后，各時相組心臟重量指數(shù)均顯著高于對照組心臟重量指數(shù)（P<0.05），具體結果詳見先前報道［4］。

2.2 PPARα mRNA表達

2.2.1 一次力竭運動

如表2所示，一次力竭游泳運動后4小時、12小時心臟竇房結PPARα mRNA表達顯著低于對照組（P<0.01，P<0.05）。一次力竭游泳運動后即刻和12小時心臟房室結PPARα mRNA表達顯著高于對照組（P<0.01）。浦肯野氏纖維PPARα mRNA表達各時相組間無顯著性差異（P>0.05）。

一次力竭游泳運動后心臟傳導系統(tǒng)不同部位PPARα mRNA表達存有差異，其中，運動后即刻房室結顯著高于竇房結（P<0.05），又顯著低于浦肯野氏纖維（P<0.01）。

總體看，一次力竭運動后傳導系統(tǒng)竇房結、房室結、浦肯野氏纖維PPARα mRNA表達在運動后4小時下降到低谷。其中，房室結變化較明顯。

表2 一次力竭運動后大鼠PPARα mRNA相對表達量

2.2.2 反復力竭運動

如表3所示，反復力竭游泳運動后4小時、12小時和24小時心臟竇房結、浦肯野氏纖維PPARα mRNA表達均顯著低于對照組和運動后即刻 （P<0.01），其中，運動后即刻組竇房結PPARα mRNA表達又顯著高于對照組 （P<0.01），24小時房室結PPARα mRNA表達顯著低于對照組（P<0.05）。

反復力竭游泳運動后心臟傳導系統(tǒng)不同部位PPARα mRNA表達有差異。運動后即刻房室結PPARα mRNA表達顯著高于竇房結 （P<0.05），但低于浦肯野氏纖維（P<0.05），運動后4小時房室結顯著高于竇房結和浦肯野氏纖維（P<0.01）；運動后12小時房室結顯著低于浦肯野氏纖維 （P<0.05），運動后24小時浦肯野氏纖維顯著高于竇房結和房室結（P<0.01）。

總體看，反復力竭運動后傳導系統(tǒng)竇房結、房室結、浦肯野氏纖維PPARα mRNA表達基本一致。運動后開始下降，4小時到低谷，其中竇房結、房室結變化更明顯。

2.2.3 不同力竭方式運動比較

如圖1所示，反復力竭后即刻竇房結PPARα mRNA表達顯著高于一次力竭后即刻（P<0.05），反復力竭后12小時和24小時又顯著低于一次力竭后12 小時（P<0.05）和 24 小時（P<0.01），其他時相組間比較無明顯差異（P>0.05）。兩種不同方式力竭運動后心臟傳導系統(tǒng)房室結PPARα mRNA表達有差異，反復力竭后即刻顯著高于一次力竭后即刻（P<0.01），反復力竭后12小時顯著低于一次力竭后12小時（P<0.01），其他時相組間無明顯差異（P>0.05）。反復力竭后24小時心臟浦肯野氏纖維PPARα mRNA表達顯著低于一次力竭后24小時（P<0.01），其他各時相組間無明顯差異（P>0.05）。

表3 反復力竭運動后大鼠PPARα mRNA相對表達量

圖1 兩種不同力竭運動后大鼠心臟傳導系統(tǒng)PPARα mRNA相對表達量比較

2.3 PPARα蛋白表達

2.3.1 一次力竭運動

如表4所示，一次力竭游泳運動后12小時心臟竇房結PPARα蛋白表達顯著高于對照組和運動后4小時（P<0.05）。運動后即刻、12小時房室結PPARα蛋白表達顯著高于對照組 （P<0.01），4小時、24小時顯著低于運動后12小時（P<0.01）。運動后即刻、4小時、12小時浦肯野氏纖維PPARα蛋白表達顯著低于對照組（P<0.01），4 小時、12 小時顯著低于即刻（P<0.01），24小時顯著高于對照組和其他各時相組（P<0.01）。

一次力竭游泳運動后心臟傳導系統(tǒng)不同部位PPARα蛋白表達存有差異。運動后即刻竇房結PPARα蛋白表達顯著低于房室結（P<0.05）和浦肯野氏纖維（P<0.01），房室結顯著低于浦肯野氏纖維（P<0.01）。運動后12小時房室結顯著高于竇房結和浦肯野氏纖維（P<0.01）。運動后24小時浦肯野氏纖維顯著高于竇房結和房室結（P<0.01）。

總體看，一次力竭運動后傳導系統(tǒng)竇房結、房室結、浦肯野氏纖維PPARα蛋白表達在運動后4小時下降到低谷。房室結變化較明顯，出現(xiàn)兩個波峰。運動后浦肯野氏纖維PPARα蛋白表達明顯高于竇房結和房室結。

表4 一次力竭運動后大鼠PPARα蛋白表達灰度值變化

2.3.2 反復力竭運動

如表5所示，經反復力竭游泳運動后，心臟傳導系統(tǒng)竇房結、房室結PPARα蛋白表達即刻顯著高于對照組和其它各運動組（P<0.01）。

浦肯野氏纖維PPARα蛋白表達對照組顯著高于其它各運動組（P<0.01），即刻顯著高于 4、12、24小時（P<0.01）。

心臟傳導系統(tǒng)不同部位在反復力竭游泳運動后存有差異。其中即刻，房室結PPARα蛋白表達顯著高于浦肯野氏纖維（P<0.05）。4小時和12小時，竇房結顯著低于房室結（P<0.05）和浦肯野氏纖維（P<0.01）。24小時，浦肯野氏纖維顯著高于竇房結和房室結（P<0.05）。

表5 反復力竭運動后大鼠PPARα蛋白表達灰度值變化

總體來看，反復力竭運動后傳導系統(tǒng)竇房結、房室結、浦肯野氏纖維PPARα蛋白表達規(guī)律基本一致。運動后4小時下降到低谷，其中，竇房結、房室結的變化較為明顯。

2.3.3 不同力竭方式運動后比較

圖2 兩種不同力竭運動后大鼠心臟傳導系統(tǒng)PPARα蛋白表達比較

如圖2所示，反復力竭后即刻心臟竇房結PPARα蛋白表達顯著高于一次力竭后即刻 （P<0.01），反復力竭后12小時顯著低于一次力竭后12小時（P<0.01），其他時相組間無明顯差異（P>0.05）。兩種不同方式力竭運動后心臟房室結PPARα蛋白表達有差異，反復力竭后即刻顯著高于一次力竭后即刻（P<0.01），反復力竭后12小時顯著低于一次力竭后12小時（P<0.01），其他時相組間無明顯差異（P>0.05）。兩種不同方式力竭運動后心臟傳導系統(tǒng)浦肯野氏纖維PPARα蛋白表達有差異，反復力竭后24小時顯著低于一次力竭后24小時（P<0.01），其他時相組間無明顯差異（P>0.05）。

3 討論

過氧化體增殖物激活型受體（peroxisome proliferator-activated receptor，PPARs）是一種致密分子構成的類固醇受體超家族核受體，有PPARα、PPARβ和 PPARγ3 種亞型［6］。與其它核受體一樣，PPARα 在代謝旺盛的組織表達極為豐富，在肝細胞、心肌細胞、腸細胞及腎近曲小管細胞呈高水平表達。其主要功能為介導與脂肪酸氧化有關的基因的活化，使體內脂肪酸氧化/甘油酯化平衡趨向于分解代謝途徑；參與調節(jié)炎癥過程［7］。有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌缺血缺氧時，脂肪酸氧化減少，葡萄糖氧化增加，減少心肌氧耗，增加心肌對缺血和缺氧的耐受性，阻止細胞凋亡，認為這種能量代謝轉換可能具有一定的心肌保護作用［8］。心肌線粒體大部分編碼脂肪酸氧化酶核基因的表達是由PPARα調控的，心肌的這種保護作用是通過下調PPARα表達實現(xiàn)的［9］。一旦心肌灌注恢復，PPARα表達未及時恢復，雖然氧供應充足，但脂肪酸氧化未增加，心肌能量供應相對不足，對缺血再灌注的心肌恢復也是不利的［10，11］。 有研究發(fā)現(xiàn)，實驗性缺血再灌注大鼠心肌PPARα表達減少，同時伴有血清游離脂肪酸增多。還有文獻報道，PPARα在心臟還發(fā)揮抗炎作用［12］，對心臟有保護作用，PPARα激動劑可抑制由脂多糖誘導的腫瘤壞死因子α和核因子κB在心肌的基因表達，提示PPARα激動劑可能通過調控炎癥因子發(fā)揮抗炎作用，減少心肌受損。

PPARα是心肌脂質和能量代謝的重要調控轉錄因子，調控出生后心肌線粒體編碼脂肪酸β氧化（FAO）酶的大部分核基因表達［13］。研究表明，缺氧時PPARα失活，隨之下調FAO酶基因表達。本研究發(fā)現(xiàn)，一次力竭運動后竇房結PPARα mRNA與蛋白表達呈先下降后升高的趨勢。分析認為，一次力竭運動導致竇房結急性缺氧，PPARα失活，F(xiàn)AO酶基因表達下調，進而使脂肪酸β氧化受到抑制，產能減少。竇房結細胞供能障礙，引起細胞結構和功能的改變，進而引起竇房結起搏和傳導功能受限，構成運動性心律失常的發(fā)生機制。隨力竭運動后恢復時間的延長，PPARα活性逐漸恢復。反復力竭運動后竇房結PPARα mRNA與蛋白表達呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，運動后即刻PPARα代償性升高，有氧氧化代償性加快，之后隨著缺血再灌注加重竇房結損傷，引起PPARα表達相對下降，竇房結細胞嚴重損傷，且恢復緩慢，至24小時有所回升，且反復力竭后回升速度顯著低于一次力竭。這提示反復力竭運動對竇房結的影響較重，可能增加運動性心律失常的發(fā)生幾率。

本研究發(fā)現(xiàn)，一次力竭運動后房室結PPARα mRNA和蛋白表達出現(xiàn)兩個波峰。一次力竭運動后即刻PPARα代償性增加，脂肪酸氧化增強，供能增加。隨著缺氧的加重，PPARα活性逐漸降低，曲線下降。氧供恢復后，PPARα大量被激活，有氧氧化能力增強，產能增加。故曲線有所波動。反復力竭運動后呈先升高后下降的趨勢。反復力竭運動后呈PPARα代償性增加，脂肪酸氧化增強，能量代償性增加，隨恢復時間的延長，能量消耗增加，致使缺氧加重，PPARα失活，曲線下降。PPARα表達未及時恢復，雖然氧供應充足，但脂肪酸氧化并未增加，心肌能量供應相對不足。

心肌缺血缺氧時，能量代謝障礙是造成缺血心肌損傷的主要因素［14，15］。 心臟是高氧耗的器官，一旦缺血缺氧，心肌細胞迅速由有氧代謝轉為無氧代謝。本研究發(fā)現(xiàn)，一次力竭運動后浦肯野氏纖維PPARα mRNA和蛋白表達呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢，運動后24小時升高最明顯。一次力竭運動后PPARα表達失活，可使FAO酶基因表達下調，脂肪酸β氧化受到抑制，產能減少。浦肯野氏纖維細胞供能障礙，可能引起心室內興奮傳導異常。隨著運動后恢復時間的延長，PPARα表達被激活，功能逐漸恢復。反復力竭運動后呈下降趨勢，運動后4小時明顯下降一直持續(xù)到24小時，且運動后4小時、12小時、24小時均顯著低于對照組和運動后即刻。反復力竭刺激引起PPARα表達持續(xù)失活，脂肪酸β氧化持續(xù)受到抑制，產能障礙。反復力竭運動后浦肯野氏纖維能量代謝嚴重不足，其各種功能均受到抑制，室性心律失常發(fā)生率大為增加，嚴重者可能導致心力衰竭。

4 小結

4.1 力竭運動后心臟傳導系統(tǒng)各部位能量代謝調控因子PPARα在mRNA和蛋白水平出現(xiàn)異常低表達，易引起傳導系統(tǒng)能量代謝障礙，構成運動性心律失常的病理過程和發(fā)生機制。

4.2 力竭運動后傳導系統(tǒng)各部位PPARα mRNA和蛋白表達有時相規(guī)律，不同力竭運動后竇房結、房室結、浦肯野氏纖維PPARα mRNA和蛋白表達均在運動后4小時降至低谷。

4.3 力竭運動后傳導系統(tǒng)不同部位PPARα mRNA和蛋白表達存在差異，竇房結PPARα在mRNA和蛋白異常低表達變化規(guī)律基本一致，呈持續(xù)性低表達，房室結在12小時有所波動，而浦肯野氏纖維在一次力竭運動后24小時PPARα在mRNA和蛋白低表達狀況有恢復趨勢，進一步提示反復力竭運動對心臟傳導系統(tǒng)的影響更為明顯。

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