李鴻茹 陳愉生 邵 慧 韓莉莉 張祥娥

?

福建漢族人胰島素樣生長因子受體基因多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌易感性的研究*

李鴻茹1陳愉生1邵 慧1韓莉莉2張祥娥1

1.福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院呼吸內(nèi)科；2.福建省心血管重點實驗室

：探討胰島素樣生長因子受體（IGF-1R）基因多態(tài)性與福建漢族人非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）易感性的關(guān)系。：應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）和DNA測序方法檢測福建籍漢族NSCLC患者260例和健康人258例的IGF-1R+1013和IGF-2R+1619兩個位點的等位基因分布，探討不同基因型與NSCLC發(fā)病的關(guān)系。：IGF-1R+1013（G/A）基因型和各等位基因的頻率在兩組中分布有顯著性差異（< 0.05），與GG基因型者相比，GA、AA基因型者NSCLC患病風(fēng)險均顯著增加（< 0.05），未發(fā)現(xiàn)IGF-2R+1619（G/A）位點各基因型和等位基因的頻率分布在兩組中的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（> 0.05）。根據(jù)病理類型分層分析發(fā)現(xiàn)，IGF-1R+1013（G/A）變異等位基因A攜帶者（GA+AA）患肺鱗癌、腺癌、其他類型肺癌的風(fēng)險增加2.20倍、0.55倍、0.96倍（< 0.05）。未發(fā)現(xiàn)IGF-1R+1013、IGF-2R+1619兩基因多態(tài)性與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)（＞0.05）。兩基因多態(tài)性的聯(lián)合分析顯示，同時攜帶IGF-1R+1013（G/A）和IGF-2R+1619（G/A）A等位基因者NSCLC的患病風(fēng)險增加（= 0.003）。：IGF-1R+1013（G/A）中，變異等位基因A是肺癌發(fā)生的危險因素，IGF-1R+1013（G/A）和IGF-2R+1619（G/A）基因多態(tài)性對肺癌的易感性有協(xié)同作用。

IGF-1R IGF-2R 基因多態(tài)性 非小細(xì)胞肺癌

目前，肺癌已成為發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]。IGF-1R+1013（G/A）和IGF-2R+1619（G/A）是目前研究最多的且與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的兩個單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點[2]，但迄今在中國人群中，該兩位點基因多態(tài)性未見報道。本文分析了福建地區(qū)漢族人群這兩個位點的單核苷酸多態(tài)性，以探討其與NSCLC發(fā)病的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。肺癌血清標(biāo)本來自于2010年10月～2011年6月經(jīng)病理確診的260例NSCLC患者，其中男性173例，女性87例，男女比例約2 : 1，年齡范圍35～93歲，平均年齡61.1歲；258例自愿參加的健康人群血清作為對照組，其中男性171例，女性87例，年齡范圍為39～90歲，平均年齡58.24歲，兩組性別、年齡無統(tǒng)計學(xué)差異。納入標(biāo)準(zhǔn): ①每份樣品均為3代以內(nèi)無異族通婚史且無親緣關(guān)系的血液標(biāo)本，并與受檢者簽署知情同意書。②對照組均無其他部位原發(fā)腫瘤。③所有病例與對照均為居住在當(dāng)?shù)?0年以上的漢族常住人口。收集病例組研究對象的組織類型、TNM分期等臨床特征，TNM分期采用UICC第七版腫瘤分期，組織類型根據(jù)2004年WHO公布的“肺及胸膜腫瘤組織學(xué)分類修訂方案”進(jìn)行分型，將大細(xì)胞肺癌和未分化及未定性肺癌統(tǒng)稱為其他型肺癌。

1.1.2 試劑。人血液基因組DNA提取試劑盒購自廈門泰京生物技術(shù)有限公司，PCR反應(yīng)試劑購自大連寶生物工程有限公司，MnlI、NciI限制性內(nèi)切酶購自Fermentas公司，PCR擴(kuò)增引物由上海生工生物有限公司設(shè)計合成。

1.1.3 儀器。PCR儀（德國EPPENDORF），VDS-CL凝膠成像系統(tǒng)（瑞典PHARMACZA，JS-680D），紫外分光分度計(BECKMAN，DU-640)，瓊脂糖電泳儀（北京儀器廠），低溫度高速離心機(jī)（力新儀器上海有限公司），恒溫水浴箱（新康器械）。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取。抽取每個研究對象外周肘靜脈血5mL，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，用DNA提取試劑盒提取基因組DNA，紫外分光分度計對DNA的濃度和純度進(jìn)行檢測，純度保證( 260 nm/280 nm) OD 值在1. 8~ 2. 0 之間。DNA置-20℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）分析。設(shè)計引物如下： G→A(Glu 1013 Glu)（SNP No：rs2229765），sense primer：5’-CAGGGGTCGTTTGGGATGGTC-3’,anti sense primer 5’-CCTGTGCTGCATTTTGGCTTTTC-3，以MnlI酶切可得到不同的基因多態(tài)性片段分別為：GG: 103、84 bp；GA: 103、84、123bp；AA: 84、123bp。G→A(Gly 1619 Arg) （SNP No：rs629849），sense primer：5’-AACAATGGTTAA- AGCCGGATTG-3’,anti sense primer ：5’-GGCCCGGGTGC- AGCCAGGCACTG-3’，以NciI酶切可得到不同的基因多態(tài)性片段分別為：GG: 307、149 bp；GA: 456、307、149 bp；AA: 456bp。PCR擴(kuò)增體系（25uL）含0.4umol/L上下游引物，0.02mmol/L dNTPs，1.25U TaKaRaTaq酶，1×PCR buffer， 100ngDNA模板，加蒸餾水至25ul。IGF-1R反應(yīng)條件為：94℃變性20 s，54℃退火20 s，72℃延伸30s；共36個循環(huán)，末次循環(huán)后，72℃再延伸10 min，產(chǎn)物為207bp。IGF-2R反應(yīng)條件為：94℃變性30 s，67℃退火60 s，72℃延伸30 s；共30個循環(huán)，末次循環(huán)后，72℃再延伸15 min，產(chǎn)物為456bp，以蒸餾水替代模板DNA 作為陰性對照。取10uL PCR反應(yīng)產(chǎn)物、1U限制性內(nèi)切酶，2uL 10×buffer tango，18uL無菌去離子水，37 ℃水浴過夜。取5uL酶切產(chǎn)物經(jīng)3 g/L瓊脂糖凝膠電泳, 100 V 20 min，凝膠成像系統(tǒng)顯影，隨機(jī)抽取10%的DNA 標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)實驗。

1.2.3 DNA測序。取50μL PCR產(chǎn)物連同其上游引物由英濰捷基貿(mào)易有限公司,采用雙脫氧法在ABI_3730XL 測序儀上進(jìn)行單向測序。DNA測序圖譜中，SNP位點只有一個峰G或A，表明是純合子GG或AA型，SNP位點出現(xiàn)兩個峰，表明是雜合子GA型。隨機(jī)選擇5% 樣本進(jìn)行DNA 測序, 測序得到的基因型與采用PCR-RFLP 方法得到的基因型完全相同（圖1、圖2）。

①: IGF-1R PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶MnlI消化后的電泳圖. M: marker；1泳道：GG型；3泳道：AA型；2，4泳道：GA型； 5泳道：陰性對照；②: IGF-1R+1013多態(tài)性位點測序圖。

圖1 IGF-1R+1013（G/A）瓊脂糖電泳及測序結(jié)果

①: IGF-1R PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶NciI消化后的電泳圖. M: marker；3泳道：GG型；2泳道：AA型；1，4泳道：GA型； 5泳道：陰性對照； ②: IGF-1R+1619多態(tài)性位點測序圖。

圖2 IGF-1R+1619（G/A）瓊脂糖電泳及測序結(jié)果

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18. 0 軟件，以χ檢驗比較各基因型及等位基因在病例組與對照組分布的差異,多因素Logistic regression方法統(tǒng)計比值比(odds ratio，OR)和95％可信區(qū)間(confidence interval，CI)，且經(jīng)性別、年齡等混雜因素校正。Spearman 等級相關(guān)分析基因型與肺癌分化程度、原發(fā)腫瘤TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期的線性關(guān)系，雙側(cè)<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IGF-1R+1013（G/A）和IGF-2R+1619（G/A）基因多態(tài)性與肺癌患病風(fēng)險的關(guān)系

兩個位點的基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(>0.05)。病例組中IGF-1R+1013(G/A)位點的GG、GA、AA基因型和等位基因A攜帶者（GA+AA）的頻率分別為34.6%、53.1%、12.3%和65.4%，對照組的頻率分別為51.2%、43.8%、5.0%和48.8%，兩組中各個頻率的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（<0.05）。與IGF-1R+1013(G/A) GG基因型攜帶者相比，GA型攜帶者的患病風(fēng)險增加0.80倍(95%CI：1.24～2.59，=0.002)， AA型攜帶者的患病風(fēng)險增加2.59倍(95%CI：1.78～7.26，=0.000)，而等位基因A（GA+AA）攜帶者的患病風(fēng)險增加0.98倍(95%CI：1.39～2.83，=0.000)。IGF-2R+1619(G/A)各基因型和等位基因的頻率分布在兩組中的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（>0.05）。詳見表1。

表1 IGF-1R+1013(G/A)、IGF-2R+1619(G/A)基因型及等位基因頻率分布與肺癌的患病風(fēng)險的相關(guān)性

2.2 IGF-1R+1013(G/A)和IGF-2R+1619(G/A)基因多態(tài)性與肺癌患者臨床特征之間的關(guān)系

根據(jù)肺癌病理類型進(jìn)行的分層分析發(fā)現(xiàn)，與IGF-1R+ 1013(G/A) GG基因型攜帶者相比，IGF-1R+1013(G/A)的變異等位基因A攜帶者(GA+AA)患肺鱗癌的風(fēng)險增加2.20倍(95% CI: 1.75～5.84，=0.000)，患肺腺癌的風(fēng)險增加0.55倍(95% CI: 1.00～2.41，=0.049)，患大細(xì)胞肺癌、未定性肺癌等其他型肺癌的風(fēng)險增加0.96倍(95% CI: 1.10～3.49，=0.023)。IGF-2R+1619(G/A)基因多態(tài)性與病理類型無關(guān)（＞0.05）（見表2）；Spearman 等級相關(guān)分析基因突變與肺癌患者臨床特征之間的線性關(guān)系未發(fā)現(xiàn)IGF-2R+1013(G/A)和IGF-2R+1619(G / A)基因多態(tài)性與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)（＞0.05），IGF-1R+1013(G/A)和IGF-2R+1619(G/A)基因的突變率并未隨著腫瘤的T N M分期等的增加而增加（＞0.05）（見表3）。

表2 IGF-1R+1013(G/A)和IGF-2R+1619(G/A)基因多態(tài)性與肺癌癌病理類型的關(guān)系

注: 其他類型包括大細(xì)胞癌、未分化及未定性肺癌。

表3 IGF-1R+1013(G/A)和IGF-2R+1619(G/A)基因型與肺癌患者臨床特征之間的關(guān)系

2.3 IGF-1R+1013(G/A)和IGF-2R+1619(G/A)基因多態(tài)性的聯(lián)合作用

表4進(jìn)一步分析了IGF-1R+1013(G/A)和IGF-2R+ 1619(G/A)各種基因型組合與肺癌的關(guān)系。結(jié)果顯示，與同時攜帶這兩個基因的GG基因型的個體相比，攜帶IGF-1R +1013(G/A)的GA基因型和IGF-2R+1619(G/A)的GA基因型的個體患肺癌的危險性增加1.05倍(95% CI: 1.18～3.57，=0.011)，攜帶IGF-1R+1013(G/A)的AA基因型和IGF-2R+ 1619(G/A)的GG基因型的個體患肺癌的危險性增加1.86倍(95% CI: 1.17～7.03，=0.022)，攜帶IGF-1R+1013(G/A)的AA基因型和IGF-2R+1619(G/A)的GA基因型的個體患肺癌的危險性增加3.54倍(95% CI: 1.41～14.60，=0.011)，肺癌組中未檢測到同時攜帶IGF-1R+1013(G/A)的AA基因型和IGF-2R+1619(G/A)的AA基因型的患者，兩基因聯(lián)合多態(tài)性與NSCLC的易感性有關(guān)（=0.004）。

表4 IGF-1R+1013(G/A)和IGF-2R+1619(G/A)聯(lián)合作用與肺癌易感性的關(guān)系

3 討論

基因定位于15q25-26，全長約100 kb，有21個外顯子。IGF-1R蛋白是一種酪氨酸激酶跨膜蛋白受體，由兩個a-亞基(130-135KDa)和兩個β亞基(90-95KDa)通過二硫鍵結(jié)合而形成四聚體(α2β2), 與細(xì)胞外配體結(jié)合后，通過Ras/Raf/MEK/ERK 和PI3K/AKT兩條信號傳導(dǎo)通路促進(jìn)細(xì)胞存活及抗細(xì)胞凋亡的作用[3]。IGF-1R主要與IGF-1、IGF-2和胰島素相結(jié)合，研究表明，IGF-1R在包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤中高表達(dá)[4]，并與腫瘤的分化程度相關(guān)[5-6]，16外顯子上第1013編碼谷氨酸的密碼子出現(xiàn)G→A的突變（突變率0.49）與血清中IGF-1水平及人類壽命有關(guān)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1R +1013(G/A)攜帶A變異等位基因的基因型(GA+AA) 在NSCLC組的頻率顯著高于對照組的，提示該位點A變異等位基因是肺癌發(fā)生的危險因素，這與MacDonald K等在食管癌的研究結(jié)果一致[8]。但G-A等位基因突變?nèi)绾螌?dǎo)致氨基酸合成改變進(jìn)而影響蛋白質(zhì)功能，使肺癌發(fā)生風(fēng)險增加的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

基因定位于6q26，約136kb，含有48個外顯子，其編碼的蛋白質(zhì)是一個無內(nèi)在催化活性的跨膜糖蛋白,與IGF-2配體結(jié)合后不能傳導(dǎo)信號反而加速IGF-2的降解，目前認(rèn)為IGF-2R對IGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路所起的作用很可能是負(fù)向調(diào)節(jié)性的。IGF-2R基因座位有高頻率的雜合性缺失(LOH)，并且在相當(dāng)比例的等位基因中存在點突變[9]。Savag1[10]等報道，IGF2R基因內(nèi)多個SNP與骨肉瘤的發(fā)病風(fēng)險有關(guān)。IGF-2R的轉(zhuǎn)錄區(qū)1619位點G→A的突變造成IGF-2R結(jié)合域中甘氨酸被精氨酸替代進(jìn)而影響了IGF-2對IGF-2R結(jié)合的親和力，IGF-2基因+3580位點AA純合突變和IGF - 2R的野生純合型GG的組合對肝癌發(fā)生有保護(hù)作用[2]。Pavel檢測到肺鱗癌IGF-2R基因發(fā)生了突變，認(rèn)為IGF-2R 3’非翻譯區(qū)短串聯(lián)重復(fù)序列的基因突變可降低轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)定性[11]，與非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展有關(guān)。本研究未發(fā)現(xiàn)IGF-2R+1619(G/A)基因多態(tài)性與肺癌易感性有關(guān)（＞0.05），但分析兩基因多態(tài)性聯(lián)合作用發(fā)現(xiàn)IGF-1R+1013(G/A)和IGF-2R+1619(G/A)基因多態(tài)性對肺癌的易感性有協(xié)同作用。由于IGF-1R+1013 (G/A)變異等位基因A可能掩蓋IGF-2R+1619(G/A)基因多態(tài)性在肺癌發(fā)生中的作用，尚不能認(rèn)為IGF-2R+1619(G/A)基因多態(tài)性與肺癌易感性有關(guān)。

綜上所述，IGF-1R基因1013密碼子的突變與肺癌易感性相關(guān)，提示胰島素樣生長因子軸（IGFs）在肺癌分子發(fā)病機(jī)制中可能起重要作用，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

致謝：感謝福州市肺科醫(yī)院在標(biāo)本收集方面給予的幫助！

[1] Pandini G, Frasca F, Mineo R, et al. Insulin/insulin-like growth factor I hybrid receptors have different biological characteristics depending on the insulin receptor isoform involved[J]. J Biol Chem,2002(277):39684-39695.

[2]Weng CJ, Hsieh YH, Tsai CM, et al. Relationship of Insulin-Like Growth Factors System Gene Polymorphisms with the Susceptibility and Pathological Development of Hepatocellular Carcinoma[J]. Ann Surg Oncol, 2010(17): 1808-1815

[3]Paveli? J, Matijevi? T, Knezevi? J. Biological & physiological aspects of action of insulin-like growth factor peptide family[J]. Indian J M ed Res, 2007 (125):511-522

[4] Tao Y, Pinzi V, Bourhis J, et al. Mechanisms of disease: signaling of the insulin-like growth factor 1 receptor pathway—therapeutic perspectives in cancer[J]. Nat Clin Pract Oncol, 2007(4):591–602.

[5]Pavelic J, Krizanac S, Kapitanovic S,et a1. The consequences of insulin-1ike growth factors／receptors dysfunction in lung cancer[J]．Am J Respir Cell Mol Biol, 2005(32): 65-71.

[6]余宗陽, 歐陽學(xué)農(nóng), 杜建, 等. 非小細(xì)胞肺癌胰島素樣生長因子受體的表達(dá)及其臨床意義[J]．中國癌癥雜志, 2006, 16(8):638- 640.

[7] Bonafe M, Barbieri M, Marchegiani F, et al. Polymorphic variants of insulinlike growth factor I (IGF-I) receptor and phosphoinositide 3-kinase genes affect IGF-I plasma levels and human longevity: cues for an evolutionarily conserved mechanism of life span control[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2003(88): 3299–3304.

[8]MacDonald K, Porter GA, Guernsey DL, et al. A polymorphic variant of the insulin-like growth factor type I receptor gene modifies risk of obesity for esophageal adenocarcinoma[J]. Cancer Epidemiol, 2009(33): 37-40.

[9]Jang HS, Kang KM, Choi BO, et a1. Clinical significance of loss of heterozygosity for M6P/IGF2R in patients with primary hepatocellular carcinoma[J]. World J Gastroenterol., 2008(14):1394-1398.

[10] Savage S A, Woodson K, Walk E, et a1. Analysis of genes critical for growth regulation identifies Insulin-like Growth Factor 2 Receptor variations with possible functional significance as risk factors for osteosarcoma[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2007(16): 1667-1674.

[11]Kotsinas A, Evangelou K, Sideridou M, et al. The 3' UTR IGF2R-A2/B2 variant is associated with increased tumor growth and advanced stages in non-small cell lung cancer[J]. Cancer Lett, 2008(259): 177-185.

福建省自然科學(xué)基金(NO：2011J01130 )，福建省衛(wèi)生廳青年科研基金（NO.2010-2-7）。

李鴻茹，Email：muzi131122@163.com