王 偉，吳 倩，丁啟翠，黃建安

(1蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇蘇州215006;2山東大學(xué)第二醫(yī)院)

研究［1］發(fā)現(xiàn)，肺組織細(xì)胞凋亡參與慢性阻塞性肺疾病(COPD)的發(fā)生、發(fā)展過程，且與Caspase-3、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)等細(xì)胞凋亡相關(guān)因子有關(guān)。他汀類藥物為羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，除調(diào)脂作用之外還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用［2］。2008年12月～2011年7月，我們觀察了辛伐他汀對COPD大鼠肺組織細(xì)胞凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 30只SPF級成年雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量(228.6±7.4)g;脂多糖，辛伐他汀片(10 mg/片)，哈德門牌香煙;Trizol、PCR試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒，TUNEL 試劑盒;Caspase-3、iNOS、eNOS 引物由上海生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模 將30只大鼠隨機(jī)分為正常組、對照組、治療組，每組10只。正常組行標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，不進(jìn)行干預(yù);對照組參照文獻(xiàn)等［3，4］制作 COPD模型;治療組造模方法與對照組相同，于香煙暴露2周后，給予辛伐他汀2.5 mg/kg灌胃，連續(xù)治療6周。

1.2.2 動物處置及標(biāo)本采集 造模成功后，腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg麻醉大鼠;固定后打開胸腹腔，用10 mL的注射器抽凈下腔靜脈血。用組織剪剪破左心房，以靜脈輸液器經(jīng)右心室，灌注適量生理鹽水;將肺內(nèi)血管床中的殘留血液沖洗干凈，取出右肺，浸入4%多聚甲醛中固定72 h;常規(guī)石蠟包埋，制備5μm厚石蠟切片，其余肺組織于液氮中保存。

1.2.3 COPD大鼠肺組織原位細(xì)胞凋亡的檢測采用TUNEL法。冰凍切片干燥及過氧化物酶阻斷后，室溫孵育 10 min，PBS沖洗 5 min，3次。0.1 mol/L的TBS以1∶100稀釋蛋白酶K 37℃消化10 min，按每張切片取末端脫氧核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)和DIG-d-UTP各1μL，加10μL抗體稀釋液，每片加標(biāo)記液20μL，濕盒37 ℃孵育2 h，PBS沖洗5 min，3次。滴加封閉液，每片50μL，室溫孵育50 min，PBS沖洗5 min，3次。用抗體稀釋液1∶100稀釋生物素化抗地高辛抗體，每片50μL，37℃孵育30 min，PBS沖洗5 min，3次。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)乙醇梯度脫水，二甲苯透明，甘油封片。光鏡下計(jì)數(shù)500個細(xì)胞中TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞核呈現(xiàn)棕色或者棕黃色)。凋亡指數(shù)(AI)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.4 COPD 大鼠肺組織中 iNOS、eNOS、Caspase-3 mRNA的檢測 采用RT-PCR技術(shù)。根據(jù)用Trizol試劑提取肺組織總RNA，紫外分光光度儀鑒定其濃度及純度，瓊脂糖凝膠電泳鑒定完整性。RNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA:反應(yīng)管中依次加入5×Prime Script buffer 2 μL，Prime Script RT Enzyme Mix I 0.5 μL，Oligo dT primer(50 μM)0.5 μL，Random 6 mers(100μM)0.5μL，每10 μL體系中加入500 ng的總RNA;最后加Rnase Free dH2O至10μL，37℃ 15 min，85 ℃ 5 s。cDNA 擴(kuò)增:94 ℃ 1 min，58 ℃ 50 s，72℃ 1.5 min，40個循環(huán)72℃ 10 min;擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外燈下觀察，以擴(kuò)增產(chǎn)物的吸光度比值表示目的基因的相對表達(dá)量。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。組間比較應(yīng)用單因素方差分析，兩變量之間的關(guān)系用Pearson相關(guān)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠支氣管及肺組織細(xì)胞AI比較 各組大鼠氣道上皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞AI比較，見表1。

表1 各組大鼠氣道上皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞AI比較(±s)

表1 各組大鼠氣道上皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞AI比較(±s)

注:與正常組比較，*P ＜0.05;與對照組比較，#P ＜0.05

組別 n AI(%)氣道上皮細(xì)胞 肺泡上皮細(xì)胞正常組對照組治療組10 3.55 ±0.87 6.21 ±1.28 10 17.86 ±2.71* 31.41 ±2.67* 10 10.20 ±1.52*# 20.98 ±3.00*#

2.2 各組大鼠肺組織中 iNOS、eNOS、Caspase-3 mRNA檢測結(jié)果 各組大鼠肺組織中的Caspase-3、iNOS、eNOSmRNA相對表達(dá)量比較，見表2。

表2 各組大鼠肺組織中Caspase-3、iNOS、eNOSm RNA相對表達(dá)量比較(±s)

表2 各組大鼠肺組織中Caspase-3、iNOS、eNOSm RNA相對表達(dá)量比較(±s)

注:與正常組比較，*P ＜0.05，與對照組比較，#P ＜0.05

組別 n Caspase-3 iNOS eNOS正常組10 0.47 ±0.067 0.45 ±0.049 0.86 ±0.100對照組 10 0.83 ±0.050* 0.89 ±0.057* 0.46 ±0.053*治療組 10 0.70 ±0.068*#0.72 ±0.054*#0.63 ±0.072*#

2.4 各組大鼠肺組織中 iNOS、eNOS、Caspase-3 mRNA表達(dá)的關(guān)系 各組大鼠肺組織中Caspase-3 mRNA表達(dá)與iNOSmRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r分別為0.94、0.89、0.91，P ＜0.05)，與 eNOSmRNA 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r分別為 －0.88、－0.65、－0.92，P ＜0.05)。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀除具有調(diào)脂作用外，還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用［2］。本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用辛伐他汀治療后，大鼠肺泡上皮細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞凋亡減少。目前有研究［5～7］發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀可以通過增加eNOSmRNA穩(wěn)定性和提高一氧化氮(NO)的生物活性來抑制Caspase-3活性，減少細(xì)胞調(diào)亡。

Caspase家族是細(xì)胞凋亡的核心，不同的刺激誘發(fā)凋亡過程激活的Caspase不盡相同，但Caspase-3是不同凋亡途徑的必經(jīng)之路，是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者。研究［8～10］發(fā)現(xiàn)，肺組織和氣道凋亡的細(xì)胞增多與Capase-3的激活有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，對照組大鼠肺組織Caspase-3 mRNA表達(dá)較正常組增多，而辛伐他汀治療后大鼠肺組織Caspase-3 mRNA表達(dá)較對照組明顯減少，表明辛伐他汀能夠通過減少Caspase-3基因的轉(zhuǎn)錄，從而減輕COPD大鼠肺組織細(xì)胞的凋亡。

一氧化氮合酶(NOS)是NO合成中最主要的限速酶，可分為神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)、eNOS、iNOS［11］。在呼吸系統(tǒng)中，NOS 廣泛存在于多種組織中，且三種酶的作用各不相同。eNOS在正常生理狀態(tài)下含量較高，而iNOS在病理狀態(tài)下高表達(dá)。由nNOS和eNOS催化合成的NO，在呼吸系統(tǒng)中發(fā)揮生理性作用。生理情況下，iNOS在正常的氣道上皮及巨噬細(xì)胞可有表達(dá)，產(chǎn)生的NO可以抵抗外界有害物質(zhì)的侵襲;在各種炎癥性肺疾病中，如哮喘、COPD、特發(fā)性肺纖維化和肺囊性纖維化，氣道和肺周圍實(shí)質(zhì)中iNOS的表達(dá)上調(diào)［12］。各種介質(zhì)如TNF-α、干擾素γ、白細(xì)胞介素-1β和LPS等，均可以誘導(dǎo)iNOS的表達(dá)。Rus等［13］通過研究大鼠缺氧與復(fù)氧過程中肺組織中eNOS來源的NO的作用，發(fā)現(xiàn)當(dāng)抑制eNOS的作用時，大鼠NO的產(chǎn)生水平明顯降低，而脂質(zhì)過氧化物水平、細(xì)胞凋亡均明顯升高。Rus等［14］還發(fā)現(xiàn)，抑制iNOS產(chǎn)生的NO可以降低脂質(zhì)過氧化物、細(xì)胞凋亡以及硝基化蛋白質(zhì)的水平［17］。本研究結(jié)果顯示，對照組大鼠肺組織eNOS mRNA表達(dá)較正常組減少，而辛伐他汀治療后大鼠肺組織eNOSmRNA表達(dá)較對照組明顯增多;對照組大鼠肺組織iNOSmRNA表達(dá)較正常組增多，而辛伐他汀治療后大鼠肺組織iNOSmRNA表達(dá)較對照組明顯減少;可見辛伐他汀能通過促進(jìn)COPD模型大鼠肺組織eNOSmRNA的轉(zhuǎn)錄，減少iNOSmRNA的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而減少肺組織凋亡，減輕肺組織的破壞，為辛伐他汀在COPD中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

Caspase-3是細(xì)胞凋亡的最后執(zhí)行者，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Caspase-3 mRNA與iNOSmRNA的表達(dá)呈正相關(guān)，與eNOSmRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，考慮與iNOS的表達(dá)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，eNOS的表達(dá)減輕細(xì)胞凋亡有關(guān)。

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