雷麗萍，陳世寶，孫 聰，徐照麗，汪安云，柴家榮

（1.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 玉溪 653100；2.農(nóng)業(yè)部植物營養(yǎng)與施肥重點實驗室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081）

在土壤重金屬污染中，鎘（Cd）是影響我國煙草安全性的主要污染元素之一[1-3]。煙草屬于易累積Cd的經(jīng)濟(jì)作物之一，Cd污染脅迫不僅影響煙草的生理過程，同時也會降低煙葉的品質(zhì)[3-4]。雖然在近10多年來國內(nèi)外對煙草重金屬的相關(guān)研究取得了不少進(jìn)展[1,5-7]，但主要還是集中在對植煙區(qū)土壤和煙葉中的重金屬（包括Cd）含量的監(jiān)測、煙草土壤中重金屬的富集研究等，少量研究涉及不同重金屬污染對煙葉質(zhì)量的影響、生理反應(yīng)及其減控措施等[8-12]，而針對煙草Cd脅迫毒性與環(huán)境因子之間的量化關(guān)系研究較少。

煙草主要通過根系對Cd進(jìn)行吸收、累積，因此，不同土壤性質(zhì)對土壤中Cd的遷移、轉(zhuǎn)化特性有顯著影響，如土壤 pH、有機質(zhì)含量、陽離子交換量及粘粒含量等[1]。除了上述土壤性質(zhì)外，土壤溶液陽離子組成與含量與煙草對Cd吸收的影響還未見報道。本研究通過水培實驗，利用ISO毒性測試方法，研究溶液中 Ca、K離子濃度變化及溶液pH對煙草Cd毒性的影響，以期為煙草Cd減控措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

溶液性質(zhì)變化實驗共設(shè)鈣（Ca）、鉀（K）和pH 3個組，實驗以8.0 mg/L的Ca（以Ca(NO3)2進(jìn)行配制）作為背景溶液。8.0 mg/L的Ca2+是土壤孔隙水中Ca2+的最低濃度，也通常作為植物毒性測試的一種背景溶液[13]。溶液 Ca、K 離子濃度的變化范圍參照自然土壤孔隙水的離子濃度范圍進(jìn)行設(shè)置[13]。本試驗中，設(shè)置Ca2+離子濃度分別為0、8.0、16.0、32.0、64.0、128.0、256.0、400.0 mg/L；設(shè)置K+離子（以KNO3進(jìn)行配制）濃度分別為0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128.0、256.0 mg/L；溶液pH分別為4.52、5.04、5.57、6.02、6.55、7.09、7.47和8.10。

1.2 溶液配制

用鈣與鉀的硝酸鹽分別配制Ca2+、K+母液，通過添加不同量的母液配制成不同Ca2+、K+濃度的供試溶液。除pH組外，鈣與鉀溶液分別以2.0 mmol/L的2-嗎啉乙磺酸緩沖液（MES）調(diào)節(jié)溶液pH為6.0，每組鈣與鉀離子濃度及不同pH溶液中，通過添加Cd(NO3)2·4H2O，分別配制7個濃度的Cd溶液（0、1.12、2.24、4.48、8.96、17.92、35.84 mg/L），每處理設(shè)3次重復(fù)。

1.3 毒性測試

根伸長抑制試驗參照ISO標(biāo)準(zhǔn)（11269—1）[14]。煙草品種為云煙87。將上述煙草種子在10%（v/v）H2O2中表面消毒10 min后，沖洗干凈，放于底部鋪有紗布的培養(yǎng)皿上，濾紙用蒸餾水浸濕，然后置于溫度為（20±2） ℃無光照的培養(yǎng)箱中直到種子露白。生長箱的光照時間保持在14 h，光強度約為280 μmol/(m2·s)，相對濕度保持在80%，晝夜溫度保持在20～25 ℃。培養(yǎng)24 h后，挑選出大小一致、幼根長度約為2 mm的種子進(jìn)行根伸長抑制水培試驗。水培裝置采用頂部罩有玻璃纖維網(wǎng)的 PVC培養(yǎng)筒 (直徑7.0 cm，高12 cm)，每個處理為10粒種子，暴露于裝有不同供試溶液組的培養(yǎng)筒，然后置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。PVC培養(yǎng)筒在培養(yǎng)箱中隨機放置，每2 d更換溶液并變換燒杯的位置，培養(yǎng)7 d后測定種子的根長。相對于對照的根的伸長百分比（RE）依據(jù)公式計算：

式中，Ret為處理溶液中根的伸長（cm），Rec為對照溶液中根的伸長（cm）。

1.4 測定分析

在進(jìn)行毒性測試前，經(jīng)過消化以（石墨）原子吸收光譜法（F-AAS; Varian 220Z）（AAS）對每組溶液中Cd、Ca及K的實際含量進(jìn)行測定。預(yù)備實驗結(jié)果表明，植物生長2 d對溶液中Cd、Ca及K離子濃度影響可以忽略，因此，溶液每2 d更換1次。用梅特勒pH計（Delta320，Mettler）對溶液的實際pH進(jìn)行測定，以獲得培養(yǎng)溶液最終pH。

1.5 統(tǒng)計分析

劑量-效應(yīng)曲線擬合：溶液中Cd植物毒性的劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線采用邏輯斯蒂克分布模型（Log-logistic distribution）進(jìn)行擬合[15]。

Log-logistic曲線：

式中，x為溶液中 Cd濃度值（mg/L）；M 為ECx的自然對數(shù)值，b為參數(shù)。當(dāng)?shù)蛣┝慷疚锎碳ば?yīng)發(fā)生時，采用低劑量毒物刺激效應(yīng)（hormesis）曲線擬合[15]，通過Table curve 2D-V5.01軟件來完成。當(dāng)溶液中低濃度Cd對煙草產(chǎn)生刺激效應(yīng)時，采用低劑量刺激效應(yīng)擬合方程（Hormesis dose-response data fitting）進(jìn)行毒性效應(yīng)的擬合，方程如下：

式中，Y是煙草相對根長（%），X是溶液 Cd的濃度（mg/L），a、b、c、d是方程參數(shù)。當(dāng)k為10、50時，參數(shù)c定義為EC10及EC50。所有實驗數(shù)據(jù)均采用Excel 2007和SPSS13.0分析軟件進(jìn)行處理，LSD法檢測差異顯著性（p＜0.05）。

2 結(jié) 果

2.1 溶液pH對煙草Cd毒性的影響

溶液 pH對煙草 Cd毒性的影響濃度 EC10、EC50值及其95%置信區(qū)間見表1。可以看出，隨著pH的升高，Cd對煙草毒性的影響濃度值 EC10、EC50值逐漸增加，且EC50值變化趨勢較EC10更為明顯，這一結(jié)果表明，隨著溶液pH的逐漸升高，Cd對煙草脅迫毒性逐漸降低。就EC10變化而言，最低pH（4.52）處理Cd的10%毒害濃度值僅為最高pH（8.10）處理毒害濃度的28.4%，其中在較低pH（＜5.57）條件下，EC10之間差異并不顯著，而隨著pH逐漸升高，Cd對煙草毒害EC10顯著增加；相對EC10而言，溶液pH變化對Cd的50%毒害濃度值影響更為顯著，最低pH（4.52）處理Cd的50%毒害濃度值僅為最高 pH（8.10）處理毒害濃度的14.9%，除了pH 6.02和pH 6.55二個處理間EC50沒有顯著性差異外，EC50值隨著溶液 pH的升高EC50 值顯著增加（p＜0.05）。

表1 不同pH條件下Cd對煙草毒性的影響Table1 Effect of solution pH on Cd toxicity to tobacco

相關(guān)分析結(jié)果表明，溶液的pH與煙草Cd毒性影響濃度間呈顯著正相關(guān)關(guān)系，方程為 EC10 =3.2072pH - 12.032，R2= 0.9325**；EC50 = 12.16pH -53.7，R2= 0.7563*）。

2.2 溶液Ca離子濃度對煙草Cd毒性的影響

圖1 不同Ca離子濃度條件下Cd對煙草毒性的劑量-效應(yīng)關(guān)系（實線為模型預(yù)測值）Fig.1 The dose-response curves of Cd to tobacco with different Ca2+ in solution

通過利用邏輯斯蒂克分布模型并結(jié)合低劑量刺激效應(yīng)擬合方程對8個不同Ca2+濃度下Cd毒性進(jìn)行了測定。培養(yǎng)溶液中不同Ca2+濃度變化對煙草Cd毒害的劑量-效應(yīng)關(guān)系見圖1。從圖1A可以看出，在相對低Ca2+濃度（＜64.0 mg/L）處理下，Cd的毒害影響濃度（縱坐標(biāo)）相同時，隨著溶液Ca2+濃度的增加，溶液中Cd的濃度也逐漸增加，換言之，隨著溶液 Ca2+濃度的增加，Cd對煙草毒害濃度逐漸降低，煙草Cd的50%毒害濃度EC50與溶液Ca2+濃度之間呈正相關(guān)關(guān)系（圖2），相關(guān)關(guān)系方程為：EC50 = 0.1775[Ca2+]+ 18.03，R2= 0.8521；而隨著溶液 Ca2+濃度的逐漸增加，在相對高 Ca2+濃度（＞128.0 mg/L）處理下（圖 1B），隨著溶液 Ca2+濃度的增加，Cd對煙草毒害濃度EC50逐漸降低，此表明，溶液中Ca2+濃度的持續(xù)增加并不能降低溶液中Cd對煙草的致害濃度值。

圖2 溶液中Ca2+離子濃度與Cd對煙草毒性EC50間的關(guān)系Fig.2 Relationship between the Cd toxicity (EC50) to tobacco and Ca2+ concentration in solution

2.3 溶液K離子濃度對煙草Cd毒性的影響

溶液不同K+濃度變化對Cd煙草毒性影響濃度見圖3。就Cd對煙草毒性影響濃度EC10而言，在相對低濃度（＜64.0 mg/L）條件下，K+濃度的增加并沒有顯著降低Cd的致害濃度EC10，而隨著K+濃度逐漸增加，EC10值顯著增加（p＜0.05），不同濃度 K+處理的 Cd的 EC10變化為 8.54～20.23 mg/L。相對EC10而言，溶液中的K+濃度變化對煙草Cd毒性的EC50影響更為明顯，從圖3可以明顯看出，隨著溶液中的K+濃度的增加，EC50值逐漸增加，也即表明Cd的毒害顯著降低，不同處理Cd的EC50濃度變化為17.29～39.03 mg/L，其中對照處理EC50值為最高K+處理EC50值的44.3%。K+濃度與Cd毒害的EC50值之間呈顯著的正相關(guān)關(guān)系（EC50 = 0.0767[K+]+ 21.276，R2= 0.8709）。

圖3 不同K離子濃度條件下Cd對煙草毒性的影響Fig.3 The toxicity thresholds of Cd to tobacco as affected by different K+ concentration in solution

3 討 論

3.1 溶液pH對Cd毒性的影響

在影響煙草對Cd吸收的土壤性質(zhì)中，pH是其中重要的影響因子之一。有大量研究結(jié)果表明，土壤pH變化是影響煙草對污染土壤中Cd吸收最重要的影響因子之一[1,16-17]。進(jìn)入土壤中的 Cd2+，以不同結(jié)合形態(tài)存在于土壤固-液體系中，隨著土壤pH的升高，土壤膠體帶負(fù)電荷逐漸增加，導(dǎo)致土壤膠體對Cd離子的吸附明顯增加，從而降低Cd的遷移轉(zhuǎn)化性。

Zachara等[18]對土壤中 Cd的結(jié)合形態(tài)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH ＞ 8.0時，土壤中的Cd幾乎都以氧化鐵、鋁和硅酸鹽等植物無效態(tài)存在，而當(dāng)土壤pH為中、酸性時，Cd則以較多的有機結(jié)合形態(tài)及可交換態(tài)等有效態(tài)存在于土壤中。pH變化導(dǎo)致土壤中Cd結(jié)合形態(tài)的變化是影響煙草對Cd吸收、轉(zhuǎn)化的最根本原因。本試驗結(jié)果顯示，對于 10%的致害濃度（EC10）而言，在溶液pH ＜ 5.57的酸性條件下，隨著pH的升高，Cd的毒性雖然有所降低，但并不顯著，而隨著pH的逐漸升高達(dá)到堿性（pH ＞ 7.09）條件下，Cd的毒性顯著降低，而這一結(jié)果對于半抑制濃度（EC50）的影響更為顯著，這可能與Cd在溶液中隨著pH升高，其吸附形態(tài)的變化有關(guān)。

3.2 溶液中Ca、K離子的影響

在煙草對Cd吸收的影響因子中，除了土壤pH外，土壤溶液中陽離子的種類和含量也是其中重要影響因子之一。土壤中的金屬陽離子，如Ca、K、Co、Cu、Ni及Pb等，由于和Cd具有類似的物理、化學(xué)性質(zhì)，在一定程度上影響土壤膠體對Cd的吸附-解吸作用，從而影響土壤中 Cd的植物有效性[19-20]。土壤中膠體的種類及其交換性能對 Cd離子的吸附作用大小對煙草Cd吸收有十分重要影響。有研究表明，煙草對土壤中Cd的吸收與土壤的陽離子交換量（CEC）呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系[19]，如Adamu等[21]在13種土壤中煙草對Cd吸收實驗結(jié)果表明，煙葉中Cd的含量與土壤陽離子交換量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；另有資料報道，土壤中的 Zn通過對土壤膠體吸附位的競爭從而影響煙草對Cd的吸收、轉(zhuǎn)化。在煙草根系對Cd吸收轉(zhuǎn)運的過程中，Zn的存在會影響植物根細(xì)胞質(zhì)膜對Cd向韌皮部的轉(zhuǎn)運，而當(dāng)Zn進(jìn)入植株體內(nèi)后，Zn由于和植物蛋白產(chǎn)生競爭絡(luò)合作用從而影響植物體內(nèi)Cd的再分配過程，也即產(chǎn)生拮抗效應(yīng)[22-23]。除了 Zn外，土壤中其他金屬元素，如Fe、Ca、K等陽離子的存在也會由于Fe-Cd、Ca-Cd的拮抗作用而降低煙草對Cd的吸收、轉(zhuǎn)運[1]。

煙草根系主要通過H+-ATP酶的作用對溶液中的K+進(jìn)行主動運輸或通過低親和力的K+內(nèi)流通道和非選擇性的陽離子通道進(jìn)行被動運輸。提高溶液中K+濃度對降低煙草Cd毒性的機制可能與以下原因有關(guān)，一是提高K+濃度可以促進(jìn)煙草的生長，增強煙草對Cd脅迫的耐性，二是由于K+在溶液中通過與 Cd2+競爭陽離子吸附點位及 Cd2+進(jìn)入植物細(xì)胞陽離子運輸通道等。本研究結(jié)果表明，雖然在低濃度（＜64.0 mg/L）條件下，添加K+在一定程度上增加了煙草Cd脅迫的抗性，但就10%毒性影響濃度（EC10）而言，與對照相比并不顯著（p＞0.05），隨著溶液中K+濃度的增加，顯著降低了溶液中Cd對煙草的毒性，因此，在煙草Cd脅迫條件下，增加介質(zhì)中K的濃度，可以顯著降低Cd對煙草的毒性。

4 結(jié) 論

（1）水培試驗結(jié)果表明，隨著溶液pH的升高，Cd對煙草的毒性濃度值 EC10、EC50逐漸增加，也即表明Cd的毒性逐漸降低，溶液的pH與煙草Cd毒性影響濃度值間呈顯著正相關(guān)關(guān)系。

（2）在溶液Ca2+濃度 ＜ 64.0 mg/L處理下，隨著溶液 Ca2+濃度的增加，Cd對煙草毒害濃度逐漸降低，煙草Cd的50%毒害濃度EC50與溶液Ca2+濃度之間呈正相關(guān)關(guān)系；而隨著溶液Ca2+濃度的逐漸增加，當(dāng)Ca2+濃度 ＞ 128.0 mg/L時，溶液中Ca2+濃度的增加并不能降低Cd對煙草的毒性；與Ca2+相比，在相對低濃度（＜ 64.0 mg/L）條件下，K+濃度的增加并沒有顯著降低Cd的毒性，而隨著K+濃度逐漸增加，EC10及EC50值顯著增加，溶液中高K+濃度（＞64.0 mg/L）可以顯著降低煙草 Cd的毒性。

（3）在煙草Cd污染脅迫條件下，提高介質(zhì)pH和增加介質(zhì)中Ca2+、K+的濃度可以有效降低Cd的毒性。

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