張興儒 俞彰 盛霞 徐建江 張振永 周歡明 劉斌 朱文卿 李軼捷 項敏泓 李青松

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患者男性，76歲。雙眼干澀、異物感、溢淚3年，2010年7月8日來我科就診?；颊?年間曾就診多家醫(yī)院，給予抗生素滴眼液、人工淚液等藥物治療未見好轉(zhuǎn)。否認糖尿病、腎病、甲狀腺、眼部外傷等病史。眼部檢查:右眼視力0.8，松弛球結(jié)膜堆積在眼球與下瞼緣之間，皺褶明顯，超過淚河高度，結(jié)膜松弛癥分級［1］為Ⅱ級(圖1)，測淚膜破裂時間(break-up time，BUT)3 次平均為 7.33 s，基礎(chǔ)淚液分泌試驗(SchirmerⅠ test，SⅠt)為9mm;沖洗淚道通暢。2010年10月20日患者右眼在5 g/L愛爾卡因結(jié)膜囊表面麻醉下，行新月形切除手術(shù)［2］。手術(shù)后8周，癥狀消失，松弛結(jié)膜消除，淚河恢復(fù)(圖2)。BUT為9 s，SⅠt為9mm。球結(jié)膜手術(shù)切口對位愈合好，眼球運動正常。

圖1.右眼松弛球結(jié)膜堆積在眼球與下瞼緣之間，皺褶明顯，超過淚河高度

圖2.右眼結(jié)膜松弛癥新月形切除手術(shù)后8周，癥狀消失，松弛結(jié)膜消除，淚河恢復(fù)

1.2 術(shù)中組織形態(tài)觀察 采用結(jié)膜松弛癥新月形切除術(shù)［2］，開瞼后，球結(jié)膜松弛成皺褶不規(guī)則堆積。結(jié)膜囊沖洗，球結(jié)膜松弛皺褶隨水流移位幅度大。球結(jié)膜下注射2%利多卡因，藥液快速彌散在結(jié)膜下間隙中，看不到局限性隆起。在角膜緣外5mm切開球結(jié)膜，球結(jié)膜變薄，筋膜萎縮。球結(jié)膜切開后直接看到鞏膜表面，球結(jié)膜與筋膜與鞏膜黏合力明顯下降，球結(jié)膜容易移位?？p合切口時球結(jié)膜彈性差，容易撕裂。手術(shù)切口愈合緩慢。

1.3 相干光斷層掃描 結(jié)膜松弛癥手術(shù)前右眼在順時針7:30方位，距角膜緣5mm外，采用相干光斷層掃描(optical coherence tomography，OCT)(CirrusTMHD-OCT 4000 ，Carl Zeiss Meditec Inc)球結(jié)膜和筋膜圖像分析并進行厚度測量［3］，球結(jié)膜上皮層面凹凸不平，上皮細胞層與結(jié)膜固有層結(jié)合疏松，固有層和筋膜變薄，球結(jié)膜厚度為136μm(圖3);而對照組(年齡配對眼表正常者)球結(jié)膜上皮層形態(tài)、結(jié)構(gòu)完整，表面光滑平整，上皮層與固有層結(jié)合緊密，固有層與鞏膜的結(jié)合密切，球結(jié)膜厚度為236μm(圖4)。

圖3.結(jié)膜松弛癥手術(shù)前OCT 4000下可見球結(jié)膜上皮層高低不平，上皮細胞層與結(jié)膜固有層結(jié)合疏松，固有層和筋膜變薄，球結(jié)膜厚度136μm

圖4.對照組(年齡配對眼表正常者)上皮細胞層細胞排列均勻，與基質(zhì)邊界清楚，上皮細胞層厚度為48μm;球結(jié)膜固有層組織均勻，與筋膜結(jié)合緊密，邊界清楚，球結(jié)膜厚度為236μm

1.4 共聚焦顯微鏡檢查 右眼結(jié)膜松弛癥手術(shù)前在順時針7:30方位，距角膜緣5mm外，采用Heidelberg公司生產(chǎn)的HRT共聚焦顯微鏡對球結(jié)膜各層活體觀察。結(jié)膜松弛癥上皮細胞層內(nèi)有較多的朗格漢斯細胞球(圖5)，結(jié)膜松弛癥球結(jié)膜固有層纖維稀疏不規(guī)則(圖6)。

圖5.共聚焦顯微鏡下結(jié)膜松弛癥上皮細胞層內(nèi)有較多的朗格漢斯細胞球(×800，HRT系列)

圖6.共聚焦顯微鏡下結(jié)膜松弛癥球結(jié)膜固有層纖維稀疏不規(guī)則(×800，HRT系列)

1.5 組織病理學(xué)觀察 手術(shù)切除病變組松弛結(jié)膜和對照組的對應(yīng)區(qū)結(jié)膜。立即用10%甲醛液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，做5μm 切片，用蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色、Verhoeff彈力纖維染色、Masson三色染色和Mallory磷鎢蘇木素染色。結(jié)膜松弛癥的結(jié)膜病理表現(xiàn)為結(jié)膜彎曲皺褶，厚薄不均，角化不全;上皮下組織減少、疏松，筋膜萎縮，結(jié)膜與筋膜與鞏膜結(jié)合疏松;固有層彈力纖維染色示彈力纖維明顯減少，幾乎消失(圖7)。對照組為隨機年齡配對的單純白內(nèi)障手術(shù)患者，結(jié)膜表現(xiàn)為結(jié)膜上皮層有較多的杯狀細胞，固有層與上皮層結(jié)合緊密，固有層組織均勻(圖8)。

1.6 透射電鏡觀察 手術(shù)切除松弛結(jié)膜和對照組切除的對應(yīng)區(qū)球結(jié)膜，用2.5%戊二醛液(0.1 mol/L磷酸緩沖液配制，pH=7.2)保存固定后，樣本切成＜1mm 3小塊，1%四氧化鋨(osmium tetroxide，OsO4)(0.1 mol/L 磷酸緩沖液配制，pH=7.2)后固定2 h。梯度乙醇脫水，618#環(huán)氧樹脂包埋。超薄切片經(jīng)鈾-鉛染色后在JEM-1200EX透射電鏡下觀察。

結(jié)膜上皮層超微結(jié)構(gòu):球結(jié)膜上皮細胞表層呈扁平狀，中間為多邊形，基底層細胞立方形。上皮細胞含有豐富的細胞器，如線粒體、高爾基復(fù)合體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，色素顆粒和吞噬體亦可見到。細胞間有橋粒連接，相鄰胞質(zhì)內(nèi)有張力絲。結(jié)膜松弛癥組與對照組上皮細胞超微結(jié)構(gòu)無明顯差異。

圖7.結(jié)膜上皮細胞鱗狀化增生，上皮下組織減少、疏松，筋膜萎縮，結(jié)膜與筋膜與鞏膜結(jié)合疏松(HE×100)

圖8.對照組結(jié)膜上皮層有較多的杯狀細胞，固有層與上皮層結(jié)合緊密，固有層組織均勻(HE×100)

固有層超微結(jié)構(gòu):結(jié)膜松弛癥病例顯示膠原原纖維稀疏、松散，局部點狀變性(圖9);成纖維細胞壞死，周邊膠原原纖維斷裂、扭曲，排列稀疏、松散，部分缺失(圖10)。對照組顯示周圍膠原原纖維整齊排列、緊密，無扭曲、變性、壞死(圖11);成纖維細胞核卵圓，胞質(zhì)細胞器豐富，線粒體數(shù)量不多，細胞周邊有長胞突，核內(nèi)染色質(zhì)均勻分布，在核膜下異染色質(zhì)較密集?？梢姷骄€粒體、溶酶體、脂滴及細絲狀細胞骨架成分(圖12)。

圖9.結(jié)膜松弛癥病例，膠原原纖維稀疏、松散，局部點狀變性(標尺=2μm)

圖10.成纖維細胞壞死，周邊膠原原纖維斷裂、扭曲，排列稀疏、松散，部分缺失(標尺=2μm)

圖11.對照組:膠原原纖維排列整齊、緊密，無扭曲、變性、壞死，成纖維細胞核卵圓，胞質(zhì)細胞器豐富(標尺=2μm)

圖12.對照組:成纖維細胞核卵圓，胞質(zhì)細胞器豐富，線粒體數(shù)量不多，細胞周邊有長胞突，周圍膠原原纖維整齊排列(標尺=2μm)

2 討論

結(jié)膜松弛癥是年齡相關(guān)性老年人常見眼病，隨著人口老齡化加快，結(jié)膜松弛癥患病人群將日趨增多［1，4-5］。但是結(jié)膜松弛癥的發(fā)生、發(fā)展、治療及預(yù)防等許多問題需要進一步研究。我們對一個結(jié)膜松弛癥病例采用目前先進的研究方法系統(tǒng)研究，以期相互驗證，發(fā)現(xiàn)新問題。

結(jié)膜松弛癥松弛球結(jié)膜堆積在眼球，與下瞼緣、內(nèi)、外眥部之間形成皺褶，突出于眼表曲面，影響淚液的流動、分布、排泄，淚河變窄或殘缺不全，淚液不能正常流動到淚湖區(qū)，淚湖不能聚淚，淚液不能進入淚小點，使淚液排泄出現(xiàn)障礙;松弛結(jié)膜皺褶也影響瞬目等眼表淚液功能，引起眼部干澀、異物感、溢淚、刺痛、灼痛感等癥狀。結(jié)膜松弛癥缺乏有效的藥物治療，如果結(jié)膜松弛癥引起的干澀、異物感、溢淚、視物模糊、視疲勞、疼痛等癥狀明顯;裂隙燈顯微鏡檢查球結(jié)膜過度松弛成皺褶堆積在下瞼緣、內(nèi)、外眥部之間，影響淚河，堵塞淚小點;結(jié)膜松弛癥分級≥Ⅱ級，經(jīng)規(guī)范藥物等保守方法治療3個月無明顯效果，為手術(shù)適應(yīng)證［2］。結(jié)膜新月形切除術(shù)是手術(shù)治療結(jié)膜松弛癥的主要方法［2］。新月形切除堆積在瞼緣上的松弛結(jié)膜，解除了松弛結(jié)膜對眼表的刺激癥狀，使淚河的解剖部位恢復(fù)正常;解除了松弛結(jié)膜對淚小點的堵塞，淚液排出恢復(fù)，眼瞬目恢復(fù)正常，患者癥狀解除。

如何客觀評價在結(jié)膜松弛癥手術(shù)中觀察到的球結(jié)膜基質(zhì)變薄、Tenon筋膜萎縮，球結(jié)膜與筋膜與鞏膜的黏合力下降，未見文獻報道。新一代OCT出現(xiàn)后，我們嘗試在離體豬眼用OCT測量球結(jié)膜結(jié)構(gòu)取得意外結(jié)果，并在青光眼小梁切除術(shù)的病例中預(yù)置調(diào)節(jié)縫線標記在結(jié)膜與筋膜之間，用OCT觀察球結(jié)膜得到球結(jié)膜與筋膜的分界線標志，重復(fù)性好，并與手術(shù)中的實際觀察相一致［3］。OCT掃描結(jié)膜松弛癥病例球結(jié)膜上皮層面凹凸不平，上皮細胞層與結(jié)膜固有層結(jié)合疏松，固有層和筋膜變薄，球結(jié)膜厚度(136μm)變薄與對照組球結(jié)膜厚度(236μm)比較差異明顯，與手術(shù)中觀察到結(jié)膜松弛癥病例球結(jié)膜變薄、筋膜萎縮相一致，在活體上客觀測量了球結(jié)膜厚度。

本病例手術(shù)切除的松弛結(jié)膜組織用HE染色、Verhoeff彈力纖維染色、Masson三色染色和Mallory磷鎢蘇木素染色觀察:結(jié)膜松弛癥的結(jié)膜病理表現(xiàn)為結(jié)膜彎曲皺褶，鱗狀上皮增生，厚薄不均，角化不全;固有層變薄，彈力纖維明顯減少，幾乎消失，膠原纖維融解壞死。與研究者［6-7］報道的結(jié)膜松弛癥球結(jié)膜固有層中膠原纖維融解、彈力纖維的減少結(jié)果相一致。結(jié)膜松弛癥的球結(jié)膜上皮層杯狀細胞較少，與以前報道［8］一致。球結(jié)膜基質(zhì)層主要由纖維組織和結(jié)締組織構(gòu)成，結(jié)膜松弛癥病例球結(jié)膜固有層膠原纖維融解、彈力纖維的減少使得球結(jié)膜變薄，彈性下降，從組織病理學(xué)的角度進一步支持了OCT的檢查結(jié)果。

我們曾在結(jié)膜松弛癥淚液中發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)相關(guān)蛋白質(zhì)和防御素［9］，結(jié)膜松弛癥淚液中細胞因子檢測發(fā)現(xiàn) TNF-α、IL-6、IL-8含量高［10］。這些都提示結(jié)膜松弛癥的發(fā)生可能與炎癥反應(yīng)有關(guān)。共聚焦顯微鏡觀察到結(jié)膜松弛癥上皮細胞層內(nèi)朗格漢斯細胞增多，進一步說明了結(jié)膜松弛癥的發(fā)生與炎癥有關(guān)。共聚焦顯微鏡觀察球結(jié)膜固有層纖維稀疏不規(guī)則、稀疏，與組織病理學(xué)結(jié)果和電鏡觀察結(jié)果一致。

2003年我們曾報道用透射電鏡對結(jié)膜松弛癥患者球結(jié)膜組織的超微結(jié)構(gòu)進行對比觀察，結(jié)膜松弛癥組的成纖維細胞胞質(zhì)中有較多中等程度擴張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離核糖體，胞質(zhì)外周區(qū)有較多衣小泡和吞飲泡［11］。本病例手術(shù)切除的松弛結(jié)膜在透射電鏡下觀察，固有層膠原原纖維稀疏、松散，局部點狀變性;成纖維細胞壞死，周邊膠原原纖維斷裂、扭曲，排列稀疏、松散，部分缺失。本結(jié)果進一步支持了組織病理學(xué)和共聚焦顯微鏡檢查結(jié)果。

結(jié)膜松弛癥的發(fā)病機制可能是由于基質(zhì)金屬蛋白酶1(matrix metalloproteinase 1，MMP1)、MMP3 的過度表達，使mmP與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)的平衡失調(diào)［12-13］，引起膠原纖維融解，彈力纖維變性，導(dǎo)致球結(jié)膜基質(zhì)和Tenon囊的過度降解，球結(jié)膜變薄，筋膜萎縮，松弛結(jié)膜堆積在下瞼緣、內(nèi)眥部、外眥部之間形成皺褶，引起眼表淚液學(xué)的異常病理循環(huán)，而發(fā)生結(jié)膜松弛癥。

本例結(jié)膜松弛癥患者研究從手術(shù)中組織形態(tài)觀察、OCT、共聚焦顯微鏡、組織病理學(xué)、透射電鏡5個方面進行系列觀察，相互驗證，為結(jié)膜松弛癥的發(fā)病機制提供了新的依據(jù)。

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